12.Способы культивирования клеточных суспензий растений

1.Культивирование клеток в жидкой среде осуществляется несколькими способами. Наиболее простым и распространенным является накопительное или периодическое культивирование. Клетки растут в постоянном объеме питательной среды на установках качального или роллерного типа. Такая система закрыта для всего, кроме газов и летучих продуктов метаболизма. Оказывается при этом в колбах накапливается значительное количество углекислого газа. После замедления роста суспензия разводится до начальной плотности, и цикл выращивания повторяется.

2. Способ, при котором клетки выращиваются в проточном режиме, называется непрерывным культивированием. В основу создания проточных систем легли опыты, в которых было обнаружено, что добавление в суспензию в фазу экспоненциального роста культуры порций свежей питательной среды позволяет долго поддерживать деление клеток. Непрерывное культивирование может осуществляться в закрытой проточной, полупроточной и открытой проточной системах.

В закрытой проточной системе суспензионная культура непрерывно снабжается свежей средой, приток которой сбалансирован оттоком равного количества использованной среды. В такой системе хорошо изучать влияние различных факторов на метаболизм клеток.

При полупроточном режиме выращивания определенная часть суспензии время от времени отбирается и оставшаяся часть разбавляется свежей средой.

Применяется для получения большой биомассы с целью ее биохимического исследования.

Открытая проточная система устроена так, что обеспечивает баланс между притоком свежей питательной среды и удалением равного объема клеточной суспензии. Скорость удаления части клеток из системы должна соответствовать скорости образования новых клеток в результате деления, это создает равновесное состояние между ростом клеток (постоянством скорости клеточного деления) и биосинтезом (постоянством состава и метаболической активности).

3. В открытой проточной системе исследуются взаимосвязи между процессами роста и метаболизма, те изменения, которые происходят при переходе клеток от одного состояния к другому, а также условия оптимального режима культивирования для получения максимального количества вторичных метаболитов.

13.Методы выращивания in vitro одиночных клеток растений

Источниками отдельных (одиночных) клеток являются клеточные суспен­зии, растущие в жидкой питательной среде, мацерация тканей растений (напри­мер, мезофилла листа), изолированные протопласты после восстановления ими клеточной стенки.

Культивирование отдельных клеток по­зволяет получать клоны и исследовать генетиче­скую и физиологическую стабильность или из­менчивость при выращивании клонового мате­риала. Для создания технологий важно изучать условия, определяющие возникновение стимулов к делению у отдельных клеток, изолированных от влияния других клеток популяции и тканей.

Изолированные из тканей растения или протопласты культивируемых клеток после обра­зования клеточной стенки являются идеальными отдельными клетками.

Отдельные клетки могут быть изолирова­ны из суспензий с использованием микромани­пулятора, проточного цитофлюориметра с сортером или путем последовательных разбавле­ний. Для использования последнего метода сус­пензия готовится разными способами:

1). 1-2 мл суспензии отбирают из супернатанта после оседания основной массы клеток.

2) . Суспензию фильтруют через фильтры с уменьшающимся размером пор (нейлоновые сетки или металлические фильтры). Для после­довательных разбавлений используют платы для . микротитрований. Это позволяет микроскопиче­ски контролировать клеточный состав при по­следовательных разбавлениях. Индукция делений отдельных клеток из суспен­зии, изолированных протопластов, отдельных или высеянных при очень низкой плотности клеток, полученных методом последовательных разбавлений, воз­можна при использовании очень богатой питательной среды, например среды

Рис. 2. Использование «няньки» - культуры суспензионных клеток при выращивании изолированных протопластов и одиночных клеток кукурузы: 1 - фольга; 2 - колба Эрленмейера; 3 - колонии клеток; 4 - фильтровальная бумага; 5 - алюминиевая сетка; 6 - пенополиуретан; 7 - суспензия клеток

Као и Михайлюка. При этом объем среды, в которую помещаются клетки, дол­жен быть минимальным (микрокапли в чашке Купрака объемом 20 мкл). Даже и при соблюдении всех этих условий процент разделившихся клеток остается низ­ким. Более эффективны методы использования ткани-«няньки» или «кормящего слоя».

Для создания «кормящего слоя» используют суспензию клеток того же вида растения, что и одиночная клетка, или близкого вида (рис. 2). Клеточная суспензия берется в ранней экспоненциальной фазе ростового цикла. Каллусная культура, служащая тканью-«нянькой», также должна быть в состоянии актив­ного роста. При достижении колонией, возникающей из отдельной клетки, вели­чины 0,5-1 мм клон может быть перенесен для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду непосредственно или на фильтр, помещен­ный на поверхность агара. Использование «кормящего слоя», ткани-«няньки» и минимального объема среды, в которую помещается отдельная клетка, связано с феноменом, носящим название «действие фактора кондиционирования». Не­смотря на многочисленные попытки определить химическую природу веществ (или вещества), индуцирующих деление отдельной клетки, и раскрыть механизм действия фактора кондиционирования, ясности здесь пока нет. Уверенно можно сказать, что это фактор химической, а не физической природы, термостабилен, включает низкомолекулярные вещества и не заменяется фитогормонами.