Genetics_sivolob_et_al

Генетика

ня молекули ДНК усередині певних елементів послідовності нуклеотидів. Рестриктази (існує кілька сотень таких ферментів) виконують у бактеріальних клітинах роль захисту від чужорідної ДНК бактеріофагів. Назви цих ферментів утворюються за таким принципом: перша велика літера позначає рід мікроорганізму, дві маленькі – вид, римські цифри та іноді великі літери – порядковий номер рестриктази серед інших рестриктаз даної бактерії. Наприклад, EcoRI – рестриктаза RI із Escherichia coli.

Послідовності нуклеотидів, які впізнаються рестриктазами, відрізняються великою різноманітністю: сайтом рестрикції є невеликі (4, 6, іноді трохи більше пар основ) паліндромні послідовності (такі, що читаються однаково в напрямку 5'-3' по обох ланцюгах, рис. 9.1). Залежно від типу рестриктази, два розрізи, які вона здійснює, можуть бути розташованими точно один напроти одного у двох ланцюгах, що зумовлює утворення так званих тупих кінців. Частіше рестриктази залишають взаємно комплементарні 5'-кінцеві (іноді 3'-кінцеві) одноланцюгові вирости – липкі кінці (рис. 9.1).

Рис. 9.1. Приклади рестриктних сайтів (ліворуч, стрілками позначено місця розрізів) та продуктів рестрикції (праворуч). Рестриктази BamHI та NotI залишають липкі кінці з 5'-кінцевими виступами,

PstI – із 3'-кінцевими виступами, HpaI – тупі кінці

Крім того, часто використовують різноманітні менш специфічні нуклеази – ферменти, що каталізують реакцію гідролізу нуклеїнових кислот. Нуклеази можуть діяти тільки на молекули ДНК (ДНКази) або РНК (РНКази); вибірково гідролізувати тільки одноланцюгову (нуклеаза S1) або дволанцюгову (екзонуклеаза ІІІ) молекулу ДНК; діяти тільки на гібридну молекулу РНК-ДНК (РНКаза Н) тощо.

272

Розділ 9. Генетична інженерія та методи молекулярної генетики

Наступний важливий для генної інженерії фермент – ДНК-залежна ДНК-полімераза (див. розділ 1). Найчастіше використовують ДНК-полі- меразу І E. coli. Їй притаманні три види каталітичної активності:

•полімеразна, що зумовлює синтез ланцюга ДНК у напрямку 5'–3' на одноланцюговій ДНК-матриці у присутності чотирьох нуклеозидтрифосфатів і короткого ДНК-праймера, який має вільну 3'-гідроксильну групу;

•3'-екзонуклеазна, яка спричиняє відщеплення нуклеотидів від 3'-кінця з метою редагування помилок;

•5'-екзонуклеазна, що забезпечує відщеплення нуклеотидів від 5'-кінця полінуклеотидного ланцюга.

За рахунок першої та третьої активностей ДНК-полімераза І одночасно може каталізувати реакцію полімеризації та гідроліз нуклеотидного ланцюга в напрямку 5'–3', починаючи з одноланцюгового розриву у дволанцюговій ДНК. Такий процес називається нік-трансляцією: при цьому розрив (нік) переміщується вздовж ланцюга ДНК у напрямку 5'–3' на відстань до однієї тисячі пар нуклеотидів. Нік-трансляцію використовують, зокрема, для введення в ДНК радіоактивно мічених нуклеотидів.

Від ДНК-полімерази І за допомогою трипсину або субтилізину можна відокремити великий фрагмент (фрагмент Кленова), що зберігає тільки полімеразну та 3'-екзонуклеазну активності. Відсутність 5'-екзо- нуклеазної активності дає змогу, зокрема, використовувати фрагмент Кленова для "заповнення" одноланцюгових 5'-кінцевих виступів, що утворюються при розрізанні ДНК рестриктазами.

Також використовують ДНК-полімеразу фага Т4. Їй притаманні ті самі активності, що й фрагменту Кленова, але її 3'-екзонуклеазна активність є у 200 разів вищою. Відповідно, цю полімеразу застосовують для введення мітки до рестриктів із виступами 3'-кінців.

ДНК-лігаза являє собою ще один із найважливіших інструментів генної інженерії. Вона каталізує синтез фосфодіефірного зв'язку між 5'-фосфатним і 3'-гідроксильними кінцями в місці одноланцюгового розрізу (ніка) у дволанцюговій молекулі ДНК. Найчастіше використовують ДНК-лігазу фага Т4, яка здатна в присутності АТР зшивати фрагменти ДНК із липкими кінцями: два взаємно комплементарні липкі кінці утворюють подвійну спіраль з двома ніками (рис. 9.1), які зашиваються лігазою.

Для синтезу ДНК на РНК-матриці використовують РНК-залежну ДНК-полімеразу – зворотну транскриптазу. Назва ферменту пов'я-

зана з тим, що він каталізує реакцію, зворотну першому етапу експресії гена – транскрипції, первинним продуктом реакції є гібрид

273

Генетика

РНК-ДНК. У генній інженерії зазвичай використовують зворотну транскриптазу з РНК-вірусів птахів (див. розділ 5). Вона складається з двох субодиниць і має щонайменше дві активності: ДНК-поліме- разну (може використовувати як матрицю одноланцюгові РНК або ДНК); активність РНКази Н (гідролізує РНК у складі гібрида РНК-ДНК, але не атакує вільну РНК). Таким чином, фермент синтезує на РНКматриці комлементарну молекулу ДНК (кДНК).

Серед інших різноманітних ферментів, які використовують у ген-

ній інженерії, слід згадати термінальну дезоксинуклеотидилтранс-

феразу, яка може нарощувати нуклеотиди на 3'-кінець одноланцюгової молекули ДНК. З її допомогою можна "підтупити" кінці ДНК (якщо 3'-кінець є коротшим) або подовжити одноланцюгові 3'-кінцеві вирости (безматричний синтез ДНК – використовуються нуклеотиди, що наявні в реакційній суміші).

Клонування ДНК

Методами клонування будь-які фрагменти ДНК, отримані за допомогою рестриктаз, можна вбудувати в плазміду або ДНК бактеріофага – вектор для молекулярного клонування, а потім розмножити ці генетичні елементи в клітинах бактерій або дріжджів, збільшуючи їхню кількість у мільйони разів.

Необхідність використання вектора зумовлена тим, що при звичайному введенні ДНК у клітини вона піддається дії нуклеаз, які розщеплюють її до нуклеотидів. Щоб ДНК стала складовою частиною генетичного апарату клітини, вона повинна або вбудуватися в її геном, або бути здатною до автономної реплікації.

Як вектор для клонування часто використовують бактеріальні плазміди (розділ 5). Основними вимогами до плазміди як вектора є наявність у її складі ориджина реплікації, унікального (одного на плазміду) сайта, що впізнається певною рестриктазою, і гена стійкості до одного з антибіотиків як селективного маркера (рис. 9.2). Із метою створення рекомбінантної ДНК очищену плазміду, яка містить єдиний сайт певної рестриктази, обробляють цією рестриктазою та отримують лінійний вектор з липкими кінцями. Далі додають фрагмент ДНК, який було вилучено за допомогою тієї самої рестриктази. За рахунок комплементарної взаємодії між липкими кінцями фрагмента й вектора утворюється циркулярний нековалентний комплекс двох молекул ДНК. Завдяки використання ДНК-лігази полінуклеотидні ланцюги зшиваються – утворюється рекомбінантна молекула ДНК. Найзручнішими є плазмідні вектори,

274

Розділ 9. Генетична інженерія та методи молекулярної генетики

котрі містять так званий полілінкер – ділянку з певним набором унікальних рестриктних сайтів, що дозволяє підібрати одну з рестриктаз, найбільш придатну для кожного випадку.

Сайт

рестрикції ORI

ampr

Рис. 9.2. Схема організації плазмідного вектора

(Ori – ориджин реплікації, ampr – ген стійкості до ампіциліну)

Фрагменти ДНК із тупими кінцями також можна вбудувати у вектор за допомогою лігази, хоча така реакція є на порядок менш ефективною. За допомогою термінальної трансферази до 3'-кінців фрагмента ДНК можна приєднати, наприклад, одноланцюговий poly(A)- хвіст, а до 3'-кінців лінійного вектора – poly(T). При змішуванні між комплементарними одноланцюговими кінцями відбудеться спарювання, остаточне зшивання завершує ДНК-лігаза. Таким чином можна об'єднувати будь-які фрагменти з тупими кінцями, незалежно від методу їхнього отримання.

Ферментативним шляхом можна утворити тупі кінці на фрагментах із липкими кінцями. Для цього або здійснюють видалення одноланцюгових виростів за допомогою нуклеази S1, або липкі кінці забудовують за допомогою фрагмента Кленова. Утворений фрагмент із тупими кінцями вбудовують у вектор за вже описаним методом.

Трансформація бактеріальних клітин рекомбінантною плазмідою здійснюється зазвичай у розчині CaCl2 або шляхом електропорації (через суспензію клітин проводиться короткий імпульс електричного струму). В обох випадках підвищується проникність клітинної стінки й рекомбінантна плазміда потрапляє всередину. Далеко не всі бактерії отримують плазміду при трансформації, і тут стає в пригоді ген стійкості до антибіотика: достатньо обробити бактеріальну культуру цим антибіотиком, щоб залишити тільки трансформовані клітини. Далі відбувається автономна реплікація плазміди й розмноження самих клітин, що приводить до значного зростання загальної кількості плазмід (рис. 9.3). Клоновані плазміди виділяють із бактеріальної

275

Генетика

культури, а обробка їх тією самою рестриктазою, що була використана при виготовленні рекомбінантної молекули, дозволяє вирізати з вектора клонований фрагмент ДНК.

Найпоширенішими плазмідними векторами сьогодні є штучні плазміди – похідні від плазміди pUC (pBluescript, pGEM). Це невеликі (~2,7 тис. пар основ) мультикопійні плазміди, що містять ген стійкості до антибіотику, ориджин і полілінкер, вбудований у ген lacZ. Полілінкер сам по собі не впливає на експресію цього гена, продуктом якої є фермент, який перетворює певний синтетичний субстрат на сполуку синього кольору. Якщо фрагмент ДНК вбудовується в полілінкер, це порушує експресію гена lacZ, і можна легко відбирати тільки ті клони бактерій, котрі містять рекомбінантну ДНК.

Бактеріальна хромосома

Трансформація

Плазміда

Ампіцилін. Реплікація плазміди, розмноження клітин

Рис. 9.3. Розмноження рекомбінантної плазміди в бактеріальних клітинах

Чим менша плазміда за розміром, тим вона стабільніша, а отже, і трансформація бактерій плазмідами є ефективнішою. Відповідно, існує обмеження в розмірі фрагментів, що їх можна клонувати описаним шляхом – до 10 тис. пар основ. Альтернативною, але цілком аналогічною технікою, що дозволяє працювати з фрагментами довжиною приблизно 20 тис. пар основ, є клонування ДНК із використання векторів на основі бактеріофага λ (див. розділ 5). За допомогою рестриктази фрагмент ДНК вбудовується у фагову ДНК, додаються порожні фагові оболонки, і здійснюється збірка фагових частинок in vitro. Рекомбінантними бактеріофагами заражають бактеріальну культуру, де відбувається їхнє розмноження.

276

Розділ 9. Генетична інженерія та методи молекулярної генетики

Використовуючи вектори на основі космід, можна клонувати фрагменти ДНК до 40 тис. пар основ. Косміда є плазмідою, яка крім ориджину, сайтів рестрикції та генів стійкості до антибіотиків містить два так звані cos-сайти: липкі кінці лінійної молекули ДНК бактеріофага λ. Саме за рахунок cos-сайтів лінійна молекула фагової ДНК циркуляризується після її проникнення в бактеріальну клітину. У лінійну косміду з такими липкими кінцями вбудовується фрагмент ДНК, який бажано клонувати. Рекомбінантна косміда упаковується in vitro у фагові частинки, якими обробляють бактеріальну культуру. У цьому випадку бактеріофаг використовується як ефективний засіб трансформації: лінійна косміда проникає в клітину, де за рахунок cos-сайтів і бактеріальної лігази циркуляризується. Далі циркулярна косміда розмножується, як звичайна плазміда за схемою на рис. 9.3.

Для клонування фрагментів ДНК від 100 тис. пар основ розроблені спеціально сконструйовані вектори ВАС і YAC. BAC-вектори створено на основі F-плазмід бактерій (розділ 5). YAC-вектор являє собою штучну дріжджову мініхромосому, яка містить центромеру, теломери і точку початку реплікації. У такий вектор можна ввести чужорідний фрагмент ДНК розміром понад 100 тис. пар основ, і така мініхромосома, уведена в дріжджову клітину, буде реплікуватись і поводити себе аналогічно до інших дріжджових хромосом при мітотичному поділі.

Більшість сучасних векторних систем поліфункціональні, тобто придатні не тільки для клонування ДНК, а й для експресії рекомбінантних білків.

Геномні бібліотеки

Розглянуті принципи клонування фрагмента ДНК залишають питання, звідки береться той чи інший фрагмент ДНК. Для того, щоб працювати з певною ділянкою ДНК (наприклад, певним геном) спочатку здійснюють клонування великої кількості різноманітних фрагментів геному – створюють бібліотеку клонів, серед яких уже шукають потрібний.

Стандартна процедура створення бібліотеки – метод дробовика (shotgun) – розпочинається з часткової (протягом обмеженого часу) обробки всієї геномної ДНК певною рестриктазою – так, щоб отримати набір різноманітних фрагментів, що перекриваються, певної середньої довжини (рис. 9.4). Усі такі фрагменти вбудовуються у вектори, після чого здійснюється трансформація. Бактерії висіваються на твер-

277

Генетика

де середовище таким чином, що кожна колонія веде походження від однієї клітини. Отже, набір колоній – це набір різноманітних клонів, кожен з яких містить один із фрагментів геному.

Аналогічно до геномних бібліотек створюють бібліотеки клонів кДНК. Для цього спочатку виділяють сумарну мРНК із клітин певного типу. Використовуючи зворотну транскриптазу та oligoT, що комплементарні до 3'-кінцевих polyA-хвостів мРНК, як праймери, на цих мРНК синтезують комплементарні ланцюги ДНК. Далі отримані молекули кДНК піддають клонуванню. На відміну від геномної, бібліотека клонів кДНК містить тільки кодуючі послідовності (екзони) генів і тільки таких генів, які є активними в клітинах даного типу.

Продукти

часткової

деградації

Рис. 9.4. Метод дробовика

Потрібну нуклеотидну послідовність серед бібліотеки клонів можна знайти за допомогою гібридизації клонованої ДНК із радіоактивно міченим ДНК-зондом (рис. 9.5). Колонії бактерій у чашці Петрі переносять на нітроцелюлозний фільтр – роблять своєрідну репліку. Потім здійснюють лізис клітин, депротеїнізацію та денатурацію ДНК у лужному розчині. Після висушування фільтра одноланцюгову ДНК необернено фіксують на ньому. Фільтр обробляють радіоактивно міченою ДНК певної послідовності – зондом. Якщо зонд комплементарний ДНК клона, відбувається гібридизація – ренатурація дволанцюгової ДНК. Детектування цього факту за допомогою авторадіографії дозволяє ідентифікувати розшукуваний клон.

Синтез зонда найчастіше проводять, використовуючи базу даних EST (Expressed Sequence Tag). База є загально доступною колекцією великої кількості коротких (200–400 пар основ) фрагментів послідовностей кДНК багатьох організмів. Достатньо знайти в EST-базі коротку ділянку, що відповідає фрагменту послідовності білка (ген якого розшукується), і синтезувати її, щоб приготувати зонд.

278

Розділ 9. Генетична інженерія та методи молекулярної генетики

Перенесення колоній на нітроцелюлозний фільтр

Депротеїнізація, денатурація ДНК

Обробка зондом

Рис. 9.5. Гібридизація клонованої ДНК із радіоактивним зондом на нітроцелюлозному фільтрі

Секвенування (див. нижче) кожного з фрагментів, які містяться в геномній бібліотеці клонів, і порівняння послідовностей фрагментів, що перекриваються (рис. 9.4), дозволяє розмістити клоновані фрагменти в порядку їхньої локалізації в геномі, тобто встановити повну послідовність геному.

Велика кількість послідовностей (у тому числі повних послідовностей геномів), які вже встановлені й продовжують накопичуватись, створює завдання їхнього збереження та аналізу. Зрозуміло, що таке завдання (яке постає вже при порівнянні послідовностей окремих клонованих фрагментів із метою з'ясувати нуклеотидну послідовність геному) може бути виконаним лише за допомогою комп'ютерів. Біоінформатика – галузь, пов'язана з вирішенням зазначених проблем, сьогодні є невід'ємною складовою частиною генетики. Найбільші загальнодоступні через інтернет бази даних нуклеотидних і амінокислотних послідовностей створено в Європейській Лабораторії Молекулярної Біології (EMBL Sequence Data Base) і Національних Інститутах Здоров'я США (GenBank). На відповідних порталах розміщено також програмні засоби порівняння послідовностей, пошуку промоторів, стартових точок транскрипції, інтронів і екзонів, визначення білкових послідовностей із послідовностей нуклеотидів тощо. На основі

279

Генетика

біоінформатичного аналізу можна встановити, наприклад, функціональне значення невідомого щойно клонованого гена по його гомології з відомим геном іншого організму, структуру гена (знайти промотор, екзони, точки термінації транскрипції), структурно-функціональні особливості нових білків, функціональні зв'язки між різними білками й генами, філогенетичні стосунки між різними таксонами. Завдяки розвитку біоінформатики з'явилась можливість, у доповнення до результатів, що отримують in vivo та in vitro, вирішувати різноманітні проблеми просто за допомогою комп'ютера – in silico.

Полімеразна ланцюгова реакція

Альтернативним і додатковим до клонування методом збільшення кількості бажаного фрагмента ДНК – ампліфікації – є полімеразна ла-

нцюгова реакція (ПЛР, або PCR – Polymerase Chain Reaction). ПЛР – це реакція синтезу ДНК in vitro, яка повторюється багато разів: синтезовані ланцюги стають матрицями для синтезу в наступному циклі реакції. Для здійснення ПЛР треба знати принаймні короткі послідовності ДНК на кінцях того фрагмента, що має бути ампліфікований.

Реакційна суміш містить слідову кількість вихідної ДНК, надлишкові кількості двох синтетичних праймерів до кінців фрагмента, нуклеозидтрифосфати чотирьох типів і ДНК-полімеразу Taq термофільної бактерії Thermus aquaticus. Використання саме полімерази Taq викликано тим, що вона не втрачає своєї активності при нагріванні до високих температур. У кожному циклі реакції відбувається нагрівання суміші до 95 °С (денатурація ДНК) і охолодження до 60 °С. Після охолодження до такої все ще досить високої температури ланцюги ДНК не ренатурують, але праймери (оскільки вони присутні в досить високих концентраціях) знаходять свої комплементарні ділянки, зв'язуються з ними, і полімераза Taq починає працювати, подовжуючи ці праймери.

Метод ПЛР має надзвичайно широке застосування. Ним послуговуються кожного разу, коли є необхідність детектувати й дослідити невелику кількість ДНК, у тому числі – у складі неочищеного біологічного матеріалу. ПЛР застосовують також у комбінації з клонуванням: ампліфікований ДНК-продукт можна клонувати й використати, наприклад, для експресії білка (див. нижче); ампліфікація за допомогою ПЛР стає в пригоді для збільшення невеликої кількості клонованої ДНК.

280