Биохимия Р.Марри

Болезнь

Несовершеииый

остеогсиез

Тип 1

Тип 11

Тип 111

Вариант с СИМlIтома­

ми Элерса- Дан­

лоеа

Сиидром Марфаиа

Синдром ЭJlсрса -Даи-

лоса

Тип IV

Тип VI

Тип VII

Тип IХ

Синдром Меике

Дефеп 1)

Proal (1)0

Proa2(1)S

Другие (неидентифицированные)

Proa 1 (I)~

Proa2 (l)s и proa2 (1)0

Другие (неидентифицированные)

Proa2 (l)CX

ProaI (l)ех или proa2(I)cx

Другие (неидентифицированные)

Proa2(1)s

Proa2(1)L

Другие (неидентифицированные)

Proa 1(111) +

Proa 1(III)sM

Proa I (111)>-

Другие (неидентифицированные) Дефицит лизингидроксилазы

Другие (неидентифицированные) Дефицит проколлаген-N-протеиназы

Proa2(J)J.

Нарушение метаболизма меди

Нарушение метаболизма меди

Последствия

Снижение вдвое количества коллагена типа I

Вероятно, аномальные фибриллы

Нестабильная тройная спираль; повышение синтеза

proaI (III)

Неясны

Синтез тримеров proa [(1)

Увеличение количества маннозы в С-пропептиде и сниже­

ние растворимости проколлагена типа 1

Нечувствительность к проколлаген-N-протеиназе и ста­

бильность pN-коллагена 2)

Вероятно, нарушение образования поперечных сшивок

Резкое уменьшение количества коллагена типа 111

Нестабильная тройная спираль

Снижение скорости секреции коллагена типа 111

Коллаген с дефицитом гидроксилизина и нарушенное образование поперечных связей

Стабильность рN-коллагена 2)

Нечувствительность к проколлаген-N-протеиназе и ста­

бильность pN-коллагена 2)

Дефицит лизиноксидазы и нарушенное образование по­

перечных связей

Дефицит лизиноксидазы и нарушенное образование по­

перечных связей

Наследственные дефекты коллагена

и его сборки

Наследственные болезни, обус;ювленные анома­ лиями коллагена, носят название колж\геНО10В. Наи­ более известные среди них: несовершенный ОСl еоге­ нез, синдром Марфана, синдром Элерса -Данлоса и синдром Менке (синдром курчавых волос). Перво­ начально зги болезни диагностировали только на основании фенотипа пробандов. но 110 мере накопле­ ния знаний о структуре и функции коллагена стано­

вились понятными молекулярные механизмы, леЖd­

щие в основе этих синдромов.

Многие клинические симптомы объясняются на­

рушением процессинга предшественников коллагена

из-за аномалий самого предшественника или дефек­

тов в ферментной системе процессинга. Понимание

молекулярной природы нарушения позволяет пред­

сказать характер наследования патологии (рецессив­

ный или доминантный).

В табл. 56.6 суммированы молекулярные дефек­

ты и их последствия при некоторых наследствен­

ных коллагенозах человека, а на рис. 56.17 указаны дефектные сайты в молекуле проколлагена

типа 1.

Adels1ein R. S., Eisenberg R. Regulation and kinetics of actin - myosin АТР interaction. Аппи. Re\'. Biochem., 1980.49. 921.

Adels1ein R. S. е1 al. Phosphorylation of muscle contractile proteins, Fed. Proc., 1980. 39, 1544.

Вагаnу М.. Вагаn)' К. Phosphorylation of the myofibrillar proteins. Аппи. Rev. Physiol .. 1980 42. 275.

Borns1ein Р., Sage Н. Structurally distinct collagen types, Аппи. Rev. Biochem., 1980. 49. 957.

Caplan А. Cartilage, Sci. Аm. (Oct.), 1984. 250, 84.

Clark М., Spudich J. А. Nonmuscle contractile proteins: The ro- lе of actin and myosin in сеН motility and shape deterrnination. Аппи. Rev. Biochem.• 1977, 46, 797.

DeCrombrugghe В., Pastan 1. Structure and regulation of а со­ I1agen gene. Trends Biochem. Sci.. 1982. 7. 11.

Dustin Р. Microtubules, Sci. Аm. (Aug.), 1980, 243. 67.

Буге D. R. е1 al. Cross-linking in collagen and elastin. Аппи. Rev. Biochem., 1984. 53, 717.

Неusег J. Е., Kirs('hner М. W. Filаmепt organization revealed in platinum rcplicas of freeze-dried cytoskelctons. J. СеН Biol., 1980, 86, 212.

Kleinman Н. А., Klebe R. J .. Martin С. R. Role of colIagenous matrices in the adhesion and gro\\·th of cells, J. Сеll Biol., 1981, 88. 473.

[дzагidеs Е. Intermediate filаmепts: А chemically heterogeneous. developmentalIy rcgulated class оГ proteins. Аппи. Rev. Biochem.. 1982. 51, 219.

La=arilles Е., Rel'el J. Р. The molecular basis of сеll movement, Sci. Аm. (Мау). 1979, 240. 100.

Миггау J. М., Weber А. The cooperative асtiоп of muscle рго­ teins. Sci. Ат. (Fcb.), 1974. 230. 59.

Prockop D. J., Kblrik/...o KI. HeritabIe diseases of collagen, N. Engl. J. Med .. 19R4. 311. 376.

Sandbng L. В., Soskel N. Т., Leslie J. С. Elastin structure. bio- sупthеsis. and relation to diseasc states, N. Engl. J. Mcd .. 1981, 304, 566.

ВВЕДЕНИЕ

Опухолевые клетки характеризуются тремя ос­ IЮВНЫМИ свойствами: 1) неконтролируемым или

слабо контролируемым ростом; 2) способностью

проникать в прилежащие ткани и повреждать их (ин­ вазивность), 3) способностью перемещаться с током крови или лимфы в другие органы и порождать там

новые очаги опухолевого роста (метастазирование).

чем старше человек, тем больше вероятность для не­ го умереть от рака. Онкологические заболевания­ тяжелейший недуг, борьба с которым-задача со­ временного общества.

БИОХИМИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ

ТЕСТЫ И РАК

Заметим, что рост клеток доброкачественных опухо­ лей тоже контролируется слабо, но эти клетки не ин­

вазивны и не метастазируют.

В данной главе мы обсудим некоторые биохими­

ческие особенности опухолевых клеток. Главная цель обсуждения- сформулировать биохимические причины свойственного им неконтролируемого ро­ ста, способности к инвазии и метастазированию. В настоящее время полагают, что одной ИЗ причин

злокачественного перерождения клеток служит из­

менение структуры и регуляции активности генов,

контролирующих их рост, а также нарушение меж­

клеточных взаимодействий. Некоторые виды опухо­ левых заболеваний (например, ряд лейкозов) являю­ тся результатом нарушения дифференцировки соот­ ветствующих клеток. Сведения о молекулярных ме­ ханизмах этого процесса крайне ограничены. По

мнению многих ведущих специалистов-онкологов,

При диагностике рака и лечении больных весьма полезны биохимические тесты. Известно, что многие формы опухолей сопровождаются нарушением про­ дукции ферментов, белков и гормонов, что можно обнаружить при исследовании плазмы или сыворот­ ки крови. Соответствующие молекулы называются опухолевыми маркерами. Анализ таких маркеров

является в настоящее время составной частью схемы

ведения больных с некоторыми типами опухолей

(табл. 57.1). В табл. 57.2 представлены примеры

использования опухолевых маркеров в диагностике

и при лечении больных. В настоящее время установ­ лено, что 1) не существует единого универсального

для всех типов опухолей маркера; нет его и для всех

пациентов с данным типом опухоли; необходим ана­ лиз целого ряда маркеров; 2) опухолевые маркеры,

усилия исследователей должны быть сосредоточены на изучении онкогенов и ростовых факторов. Имен­ но это дает возможность разобраться в природе на­

рушений контроля роста опухолевых клеток, диффе­

ренцировки, а также межклеточных взаимодействий.

Настоящая глава посвящена обсуждению проблемы онкогенов и факторов роста.

БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Опухолевые заболевания - вторая по значимо­ сти причина смертности в США после сердечно­ сосудистой патологии. Раку подвержены все воз­

растные категории людей, однако частота многих видов опухолей повышается с возрастом; поэтому

Таблица 57.1. Опухолевые маркеры, используемые при

диагностике. (Adapted, with pennission, from Mclntire К. R. Tumor markers: How usuful are they? Hosp. Pract. (Оес.), 1984, 19, 55.)

Маркер Rид опухоли

тов, направленных на клетки, со­

держащие маркеры

как правило, обнаруживаются на поздних стадиях

заболевания; между тем особенно полезными они могут быть именно в начале болезни; 3) наиболее эффективно использование опухолевых маркеров для контроля lффективности лечения, а также для обнаружения ранних рецидивов.

•

вызывают образование в тканях свободных радика­ лов. Супероксидный ОН и другие радикалы могут взаимодействовать с ДНК и другими макромолеку­

лами, повреждать их и таким образом способство­

вать возникновению рака.

ХИМИЧЕСКИЕ КАНЦЕРОГЕНЫ

ПРИЧИНЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ

Агенты, вызывающие развитие опухолей. можно

разделить на три обширные группы: радиационная

..шергия, химические соединения и вирусы.

РАДИАЦИОННАЯ ЭНЕРГИЯ

Мутагенное и канцерогенное действие оказывают

ультрафиолетовые лучи, рентгеновские лучи и "(-

излучение. Во всех случаях имеет место повреждение ДНК. Например, ультрафиолет вызывает образова­ ние пиримидиновых димеров. Результатом облуче­ ния могут быть разрывы одной или двух цепей ДНК, поперечные сшивки. Все это лежит в основе мутаген­ ного и канцерогенного эффекта облучения. Рентге­ новские и у-лучи помимо прямого влияния на ДНК

Канцерогенные свойства присущи целому ряду химических соединений (табл. 57.3); структура трех наиболее изученных веществ представлена на рис. 57.1. Канцерогенность большинства соединений, приведенных в табл. 57.3, доказана на лабораторных животных (грызунах и других). Полагают, что мно­

гие из них вызывают развитие опухолей и у человека.

Подсчитано, что до 80% опухолей человека вызы­

ваются факторами окружающей среды, в основном химическими веществами. Контакт с такими соеди­

нениями может быть связан с профессиональвой дея­ rельностью человека (б.ензол, асбест), особенностями питания (например, канцероген афлатоксин В, проду­ цируемый плесневым грибком АsреrgШus flavus, ча­

сто загрязняет арахис), образом жизни (курение).

В некоторых случаях канцерогенными оказываются лекарственные препараты. Мы рассмотрим лишь не­ которые важные выводы. сформулированные при

исследовании химического канцерогенеза.

Структура

Канцерогенами могут быть как органические, так и неорганические молекулы (табл. 57.3). Разнообра­

зие этих соединений свидетельствует о том, что кан­

церогенность не связана с какой-либо определенной

структурной особенностью.

Действие

Наиболее полно изучено действие органических канцерогенов. Было обнаружено, что некоторые из

них (например, горчичный газ и f3-пропиолактон)

являются прямыми канцерогенами, т. е. непосред­

ственно взаимодействуют с молекулами-мишенями.

Другие соединения (проканцерогены) для проявления

опухолеродной активности должны пройти ряд ме­

таболических превращениЙ. Катализируемый фер­

ментами процесс перехода проканцерotенов в актив­

ные канцерогены называется метаболической актива­ цией. Промежуточные продукты подобных реакций

носят название промежуточных канцерогенов; конеч­

ный продукт, непосредственно реагирующий с ком­

понентами клетки (например, с ДИК), называется

KOHe~ канцерогеном. Ilоследовательность тако­

А --t> промежуточный канцероген Б -. конечный кан­

цероген.

Проканцероген сам по себе химически неактивен, а конечный канцероген, как правило, обладает высо­ кой активностью. Для превращения проканцерогена

2-ацетиламинофлуорена (2-ААФ) в сульфатный

эфир N-гидрокси-ААФ (конечный канцероген) тре­ буются по меньшей мере две стадии. Важно отме­

тить, что конечные канцерогены часто являются

электрофилами (т.е. молекулами с дефицитом элек­

тронной плотности у определенных групп). Именно

поэтому они имеют повышенное сродство к нуклео­

фильным (т.е. с избытком электронов) группам ДНК. РНК и белков.

Монооксиrеназы и трансферазы

В метаболизме проканцерогенов и других ксено­ биотиков принимают участие монооксигеназы и трансферазы. Ферменты, ответственные за метабо­

лическую активацию проканцерогенов, являются

восновном гем-содержащими монооксигеназами,

локализованными в эндоплазматическом ретикулу­

ме. Эти же ферменты метаболизируют и другие ксе­

нобиотики, например лекарства и вещества, загряз­

няющие окружающую среду. Монооксигеназы ката­

лизируют гидроксилирование различных проканце­

рогенов и ксенобиотиков. при этом источником ки­

слорода служит молекулярный кислород,

а NADPH- восстановителем:

R - н + 02 + NАDРИ + Н+ --t>

R - ОН + Н2О + NADP+.

Поскольку один атом кислорода попадает в конеч­ ный продукт, другой-в молекулу воды, эти фер­

менты раньше называли оксидазами со смешанными

функциями. Реакции гидроксилирования могут при­

водить к появлению активной или неактивной фор­

мы лекарств. Очевидно, что эти реакции играют цент­

ральную роль в метаболизме многих лекарственных

препаратов. В эндоплазматическом ретикулуме кле­ ток печени человека содержится по меньшей мере

шесть монооксигеназ. Они имеют широкую, часто

перекрывающуюся субстратную специфичность. Особая монооксигеназа, метаболизирующая поли­

циклические ароматические углеводороды, называе­

тся цитохромом Р-448 или гидроксилазой аромати­

ческих углеводородов. Реакции, катализируемые

рассмотренными монооксигеназами, носят название

реакций первой фазы метаболизма ксеноБИОТИКQВ;

в результате таких реакций в соединение вводится

гидроксильная группа и продукт оказывается более полярным, более подготовленным к последующей

экскреции. Во второй фазе метаболизма ксенобиоти­

ков гидроксилированные соединения конъюгируют

с различными молекулами (например, с глюкурона­

том. сульфатом, ацетатом, глутатионом). В резуль­

тате реактивность соединений существенно понижае­

тся (детоксикация), еще более повышается их поляр­

ность, и они могут экскретироваться из организма (в

основном с мочой). Иногда конъюгация приводит к повышению биологической или химической актив­ ности молекулы. Ферменты, катализирующие реак­ ции конъюгации (глюкуронил-, сульфат-, ацетил-,

глутатионтрансферазы), обычно локализуются в ци­

тозоле, одиако некоторые из них находятся также и

в эндоплазматической сети. В качестве доноров глю­

куронильных сульфатных и ацетильных групп транс­

феразы используют UDР-глюкуронат, 3'- фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС) и ацетил­ СоА соответственно. Донором для различных глута­ тионтрансфераз служит сам глутатион.

Факторы, влияющие на ферменты,

метаболизирующие ксенобиотики

На активность ферментов, участвующих в мета­ болизме ксенобиотиков влияют многие факторы: 1)

активность ферментов может существенно варьиро­

вать у разных видов животных; 2) большой разброс

в активности ферментов у особей одного вида связан, по-видимому, с генетическими факторами; 3)

на активность ферментов влияет пол и возраст осо­ би; 4) попадание в организм некоторых ксенобиоти­ ков, например фенобарбитала или некоторых угле­

водородов, может повышать активность этих фер­

ментов. Этот процесс носит название индукции фер-

мента. Вдыхание во время беременности углеводо­

родов. содержашихся в сигаретном дыме, приводит

к индукции активности системы цитохрома Р-448

вплаценте; при этом меняется количество некото­

рых метаболитов углеводородов, с которыми кон­ тактирует плод; 5) активность ферментов, метаболи­ зируюших ксенобиотики. могут ингибировать мета­ болиты ряда лекарств. Все эти факторы объясняют

неодинаковую канцерогенность одних и тех же хи­

мических вешеств для различных видов животных

или для особей одного вида.

KOBa~...eHTHoe связывание

С помошью методики радиоактивного мечения

установлено, что при введении химических канцеро­

медленный и дорогостояший. В связи С этим были

разработаны системы скрининга, основанные на определении мутагенной активности; такие опыты

непроДолжительны и менее дороги, чем эксперимен­

ты по обнаруживанию канцерогенности. При скри­ нинге потенциальных канцерогенов весьма эффек­ тивной оказалась методика, предложенная Эймсом. Она подразумевает использование ауксотрофного

штамма Salmonella typhimurium, имеющего генотип

His-. Такие бактерии не способны синтезировать ги­ стидин, и его необходимо добавлять в культураль­

ную среду. Если под действием канцерогена проис­

ходит мутация в сайте His-, бактерии приобретают

способность расти на среде без гистидина. Клетка, несущая реверсию Иis- --t> Иis+, даст начало колонии

на агаре. не содержащем гистидина.

генов животным (или при обработке ими клеток

в культуре) происходит коваленrное связывание

этих соединений или их метаболитов с клеточными макромолекулами (ДНК, РИК или белками). Иссле­

дована химическая природа продуктов, образую­ щихся в результате взаимодействия некоторых ко­

нечных канцерогенов с их внутриклеточными мише­

нями. Наибольший интерес вызывают комплексы, образованные с ДНК. Было показано, что канцеро­

гены реагируют с пуриновыми и пиримидиновыми

основаниями, а также с фосфодиэфирными группа­

ми ДНК. Наиболее часто мишенью служит гуанин,

при этом канпсрогены присоединяются к N-2, N-3. N-7. 0-6 и 0-8 - атомам этого основания.

Повреждение дик

Ковалентное связывание прямых или конечных канцерогенов с ДИК может приводить к различного

рода повреждениям ее молекулы. Часть этих повре­

ждений клетка репарирует (см. гл. 38).

Несмотря на наличие систем репарации, некото­ рые модификации молекулы ДИК, вызванные хими­

ческими канцерогенами, могут сохраняться относи­

тельно длительное время. Возможно, именно они ве­

дут к возникновению мутаuий и развитию опухолей.

Мутагены

Большинство химических канцерогенов явля­ ются мутагенами. Для выявления мутационной ак­

тивности разработано множество тестов. Во всех случаях было показано, что при обработке бактерий конечными канцерогенами происходит целый ряд мутаuиЙ. в том числе транзиции и трансверсии (см.

гл. 38 и 40). Предполагалось. что именно они и слу­

жат причиной развития опухолей. В настояшее

время получены экспериментальные подтверждения

этой гипотезы (см. ниже «Онкогеньш). Тестирование канцерогенности химических со­

единений на лабораторных животных - процесс

Следует отметить, что набор бактериальных мо­

нооксигеназ существенно меньше такового у высших

животных. Вот почему. если химическое вещество требует активаuии для проявления канцерогенных или мутагенных свойств, это не всегда можно опре­

делить с помощью бактерий. Эймс обошел эту про­

блему, введя в тест стадию инкубации исследуемых

веществ с постмитохондриальным супернатантом

печени крыс (фракция S-9). Фракцию получают цен­ трифугированием гомогената печени крыс при 9000 g. Она содержит большую часть различных мо­

нооксигеназ и других ферментов, активирующих по­

тенциальные мутагены и канцерогены.

Благодаря методике Эймса идентифицировано

90% известных на сегодняшний день канцерогенов. Именно она используется в настоящее время при те­

стировании вновь синтезированных химических ве­

ществ. Соединения, продемонстрировавшие мута­

генную активность по методике Эймса, анализи­

руют на животных.

Инициация и промотирование

В некоторых органах (например, в коже и печени)

процесс канцерогенеза можно разделить на две ста­

дии. Рассмотрим классический пример. Определен­ ный участок кожи у группы мышей однократно

обрабатывают бензпиреном. Если не произвести до­

полнительной обработки, опухоль кожи не разви­

вается (рис. 57.2). Если же вслед за бензпиреном на

кожу несколько раз нанести кротоновое масло, раз­

вивается множество опухолей. Обработка кожи од­ ним лишь кротоновым маслом (без предварительно­

го нанесения бензпирена) не приводит к появлению

опухолей. Используя эту методику, были проведены разнообразные опыты, на основании которых мо­ жно сделать ряд выводов: 1) стадия канцерогенеза, вызываемая в данном случае нанесением бензпирена

на кожу, носит название инициации; эта стадия являе­

тся быстрой и необратимоЙ. Суть ее, по-видимому,

заключается в том, что на данном этапе происходят

356

АИн

t

Б Ин n n n

t t t t

.. Опухолей нет

Опухоли

• появляются

Гщва 57

Роль днк

Основная клеточная мишень, ответственная за

процесс канцерогенеза,- ДНК. В пользу такого вы­ вода говорит целый ряд фактов: ]) опухолевые клет­ ки производят себе подобное клеточное потомство.

Это значит, что изменения, приводящие к возникно­

ВреМЯ

Рис. 57.2. Схематическое изображение стадий инициации

и промотирования в процессе химического канцероrенеза

в коже. А. Кожа нескольких мышей однократно обрабаты­ вается инициатором (например, бензпиреном). Б. Вслед за

обработкой инициатором следуют с недельным интерва­

лом три обработки промотором (кротоновым маслом). В.

Сначала кожу обрабатывают промотором, а затем инициа­ тором. Доброкачественные опухоли кожи (папилломы) мо­ гут появляться уже через 100 дней; злокачеСТRенные опухо­ ли (карциномы) появляются примерно через 1 год. Было

вению опухолей, передаются от материнской клетки к дочерним, что согласуется с поведением ДИК; 2)

радиационное излучение и химические канцерогены

повреждают ДИК и могут вызывать мутации; 3) во

многих опухолевых клетках обнаружены аномаль­ ные хромосомы; 4) опыты по трансфекции (см. ни­ же) показали, что очищенная ДИК из опухолевых

клеток может преврашать нормальные клетки в по­

тенциально злокачественные. В процессе канцеро­

генеза могут участвовать и эпигенетические фак­

торы.

ОНКОГЕННЫЕ ВИРУСЫ

мотирования. И - инициатор; П - промотор.

необратимые модификации молекул ДНК, приводя­

щие к одной или нескольким мутациям. Бензпирен

в 'Этом случае называют инициирующим агентом: 2)

вторая, гораздо боле.е медленная (длящаяся месяцы

и годы) стадия канцерогенеза (в нашем случае­

результат обработки кротоновым маслом) называе­ тся промотированием. Кротоновое масло, таким образом, выступает здесь в роли промотирующего агента (промотора); 3) большинство канцерогенных веществ способны действовать и как инициирующие

факторы, и как промоторы.

Целый ряд соединений, в том числе фенобарби­

тал и сахарин, может играть роль промоторов в раз­

личных органах. Активное начало кротонового ма­ сла- смесь форболовых эфиров, а наиболее актив­ ный среди них-12-0-тетрадеканоилфорбол-13- ацетат (ТФА), вызывающий целый ряд эффектов.

вкачестве носителя генетической информации

уонкогенных вирусов может выступать как ДНК,

так и РНК (табл. 57.4). В этой главе мы рассмотрим

несколько наиболее важных особенностей вирусов,

принадлежащих к этим двум классам.

В формировании основных представлений о ви­

русном онкогенезе важную роль сыграли вирус по­

лиомы и вирус SV40. Это мелкие вирусы (геном око­

ло 5 т. п. н.), кольцевой геном которых кодирует все­

го 5-6 белков. В определенных условиях инфициро­

вание соответствующих клеток этими вирусами при­

водит к злокачественной трансформации. Известно,

что в этом процессе принимают участие специфиче­

ские вирусные белки. В случае вируса SV40 эти белки (их часто называют антигенами, поскольку они были идентифицированы иммунологическими методами)

известны как Т и t. Белки вируса полиомы назы-

Таблица 57.4. Некоторые важные опухолеродные вирусы

Наиболее интересными оказались данные, согласно

которым протеинкиназа С может служить рецепто­ ром ТФА. Повышение активности фермента в резу­ льтате взаимодействия с ТФА может вызвать фо­ сфорилирование ряда мембранных белков, что

в свою очередь ведет к изменению транспорта и дру­

гих функций клеток. Этот важный результат позво­

ляет связать действие некоторых опухолевых промо­

торов с их влиянием на трансмембранную передачу

сигналоа (см. ниже «Факторы роста»). Многие опу­

холевые промоторы изменяют 'Экспрессию генов; од­

нако механизмы, с помощью которых промоторы

превращают «инициированные» клетки в опухоле­

ваются T,mid-T и t. Буква Т пришла из английского

слова tumor (опухоль), поскольку первый из этих

белков был обнаружен в опухолях. До сих пор не ясно, каким образом эти белки вызывают опухоле­ вую трансформацию; известно лишь, что Т­ антигены прочно связываются с ДНК, что влияет на характер генной экспрессии. Эти белки демонстри­

руют кооперативный эффект, можно предположить,

следовательно, что при трансформации происходит

изменение нескольких процессов.

Известно несколько типов аденовирусов, транс­

формирующих определенные клетки животных. Осо­ бый интерес представляет вирус Эпштейна-Барр,

поскольку считают, что он имеет отношение к лим­

фоме Беркитта и носоглоточной карциноме у людей. Опухоли шейки матки, возможно, связаны с вирусом

простого герпеса (тип 2), а вирус гепатита В часто ас­ социируют с некоторыми формами рака печени.

Полученные в недавнее время данные об онкоге­ нах в основном базируются на исследованиях РИК­

содержащих опухолеродных вирусов, поэтому в

дальнейшем обсуждении проблемы онкогенов мы будем часто ссылаться на работы, посвященные

именно этим вирусам.

ТРАНСФОРМАЦИЯ

Культивируемые клетки, инфицированные неко­

торыми онкогенныии вирусами, могут претерпевать

злокачественную трансформацию. Наиболее суше­ ственные морфологические и биохимические измене­

ния, связанные с трансформацией, приведены в та­

блице 57.5. Изменения затрагивают форму клеток,

их подвижность и рост, адгезивность к культураль­

ной подложке, а также ряд биохимических процес­

сов. Речь идет о первичных процессах, вызывающих преврашение нормальной клетки в опухолевую, а также о вторичных - обусловленных этим превра­ щением. Большое значение в исследованиях канце­

рогенеза имеет представление, согласно которому

трансформация клеток сопряжена с приобретением ими «особых» свойств. Однако изменения клеток, известные под общим названием «трансформация», все-таки не делают трансформированные клетки идентичными опухолевым клеткам in vivo.

ОНКОГЕНЫ

Онкогены- это участки ДИК (гены), функциони­ рование которых приводит к опухолевой трансфор­ мации клеток. Открытие онкогенов имело большое значение для исследования фундаментальных меха­ низмов канцерогенеза. Впервые онкогены бьши най­ дены в опухолеродных вирусах и идентифицированы как факторы, ответственные за процесс трансформа­

ции (вирусные онкогены).

Онкогены вируса саркомы Рауса

В настоящее время исследована структура онко­ гена вируса саркомы Рауса и охарактеризован про­

дукт этого онкогена. Геном данного ретровируса со­

стоит из четырех генов: gag. ро/. env, src. Схематиче­ ски его можно изобразить следующим образом:

Ген gag кодирует синтез вирусных группоспецифиче­ ских антигенов, ген ро/-специфическую для ретро­ вирусов обратную транскриптазу, ген еnv-синтез

некоторых гликопротеинов вирусной оболочки.

Продуктом гена src, ответственного за трансформа­ цию (возникновение саркомы), является тирозино­ вая протеинкиназа. Эти данные оказались чрезвы­ чайно важными. Они продемонстрировали наличие специфического биохимического механизма, кото­ рым можно, хотя бы отчасти, объяснить плейотроп­ ный эффект ретровирусов при трансформации. Кле­ точные белки, изменение фосфорилирования кото­

рых, возможно, приводит К трансформации, еще

предстоит идентифицировать. Одним из них, по­ видимому, является виикулии- белок, найденный

вадгезионных бляшках (структурах, участвующих

вмежклеточной адгезии). Изменением фосфорили­ рования винкулина адгезионных бляшек, возможно, следует объяснять окрyrление клеток при трансфор­

мации, а также понижение клеточной адгезии к сте­

клу и другим клеткам (табл. 57.5). Мишенями тиро­

зиновой протеинкиназы, кодируемой геном src,

являются. по-видимому, некоторые гликолитические

ферменты. Это согласуется с более высоким уровнем

гликолиза, часто наблюдаемым в трансформирован­ ных клетках. Продукт гена src может также катали­ зировать реакцию фосфорилирования фосфатидили­ НОЗНТOJlа, в результате образуется фосфатидилино­ зитолмоно- и бисфосфат. При гидролизе фосфатиди­

линозитол-4,5-бисфосфата фосфолипазой С обра­

зуются инозитолтрифосфат и диацилглицерол (см.

гл. 44). Первое соединение участвует в качестве ме­

диатора в высвобождении ионов Са2 + из внутрикле­

точных компартментов (например, из эндоплазма­ тического ретикулума). Диацилглицерол стимули­ рует активность связанной с плазматической мем­

браной протеинкиназой С; этот фермент в свою оче­ редь фосфорилирует ряд других белков, в том числе, вероятно, белковые компоненты ионных насосов. Высказано предположение, что небольшое повыше­

ние внутриклеточного рН. вызываемое активацией системы Na+ /И t- -аllтипорта, стимулирует процесс митоза (см. гл. 42). Таким образом, продукт гена src может оказывать влияние на целый ряд клеточных

процессов путем фосфорилирования различных бел­ ковых мишеней и ферментов, а также, стимулируя пути синтеза полифосфоинозитидов.

Таблица 57.5. Изменения в культуре клеток, свидетель­ ствующие об опухолевой трансформации (например, после

инфекции опухолеродными вирусами). Решающий признак

малигнизации - способность клеток образовывать опухо­

ли при введении животным

Изменения морфологии: трансформированные клетки имеют более округлую форму, чем контрольные клетки

Увеличение плотности клеток (потеря контактного тормо­

жения роста): трансформированные клетки часто фор­

мируют многослойные структуры, тогда как конт­

рольные клетки растут в виде монослоя

Утрата необходимости закрепления на подложке: транс­

формированные клетки могут расти, не прикрепляясь

к поверхности культурального сосуда, и часто растут

вагаре

Утрата контактного торможения движения: трансформи­

рованные клетки могут расти и двигаться поверх дру­ гих клеток, тогда как нормальные клетки прекращают движение, когда вступают в контакт с другими клетка-

ми

Различные биохимические изменения, в том числе повыше­ ние скорости гликолиза, изменение состава клеточной

поверхности (например, изменение состава гликопро­ теинов или гликосфинголипидов), секреция ряда

протеаз

Изменения цитоскелетных структур, например актиновых микрофиламентов

Снижение потребности опухолевых клеток в факторах ро­ ста; секреция ряда факторов в окружающую среду при

этом часто повышается

Тирозиновая протеинкиназа в нормальных

и опухолевых клетках

Благодаря открытию тирозиновой протеинкина­ зы вируса саркомы Рауса стал интенсивно изучаться

процесс фосфорилирования остатков тирозина в белках. Теперь известно, что тирозиновая протеин­

киназа содержится во многих нормальных клетках.

В большинстве таких клеток количество фосфотиро­ зина мало, но при трансформации онкогенными ви­

русами, содержащими протеинкиназу, оно обычно

повышается, хотя абсолютное количество остается

невысоким (1 % всех фосфорсодержащих аминоки­

слот). Ряд рецепторов (например, фактора роста эпидермиса, инсулина, фактора роста из тромбоци­ тов) нормальных и опухолевых клеток обладает ак­ тивностью тирозиновой протеинкиназы, которая

усиливается при взаимодействии рецепторов со

своими лигандами (см. ниже «Факторы роста»). Та­

ким образом, тирозиновая протеинкиназа играет

важную роль и в нормальных, и в трансформирован­

ных клетках.

Онкогены других ретровирусов

Помимо онкогенов вируса саркомы Рауса было

обнаружено около 20 онкогенов других ретровиру­ сов. Продукты примерно половины из них представ­ ляют собой протеинкиназы (в основном тирозиново­ го типа). Иекоторые вирусные онкогены и их продук­

ты приведены в табл. 57.6. Часть из них кодирует

протеинкиназы; однако целый ряд онкогенов детер­

минирует различные другие белки, обладающие био­ логической активностью. Продукт гена erb-B вируса

эритобластоза птиц представляет собой неполную

форму рецептора фактора роста эпидермиса, про­

дукт онкогена sis вируса обезьяньей саркомы­ неполную форму В-цепи молекулы фактора роста из

тромбоцитов. Онкоген!тs одиого из вирусов, выде­

ленных из клеток саркомы кошек, кодирует синтез

фактора, стимулирующего рост колоний макрофа­ гов. Продукт гена туе, впервые обнаруженного у ви­

русов, вызывающих миелоцитому кур, представляет

собой ДИК-связывающий белок, который может ре­ гулировать митозы в клетках. Продукт онкогена ras вируса саркомы мышей связывает GTP, обладает GТРазной активностью. Вероятно, он имеет отно­

шение к белкам, регулирующим активность одного

из ключевых ферментов мембран- адени­

латциклазы (гл. 44).

Протоонкогены

Основной вопрос, который занимает исследова­ телей со времени открытия вирусных онкогенов,­

это вопрос об их происхождении. Опыты по гибри­

дизации нуклеиновых кислот (см. гл. 36) показали,

что нормальные клетки содержат последовательно­

сти ДНК, сходные (а возможно, идентичные) с ви­

русными онкогенами. Очевидно, в период внутри­ клеточного развития вирусы включают в свой геном

клеточные гены. Их присутствие в геноме вирусов, по-видимому, обусловливает определенные селек­

тивные преимущества, связанные, например, с изме­

нением характера роста трансформированных кле­

ток.

Последовательности клеточной ДИК, гомоло­ гичные вирусным онкогенам, были найдены во мно­

гих клетках эукариот; это значит, что они представ­

ляют собой важные компоненты нормальных кле­

ток. Кроме того, соответствующие мРНК и кодируе­ мые ими белки могут обнаруживаться на разных стадиях развития или жизненного цикла клеток. Та­

кие гены нормальных клеток получили название

протоонкогенов. Продукты протоонкогенов играют

сушественную роль в нормальной дифференцировке

и других клеточных процессах.

Онкогены опухолевых клеток

Опыты с ДНК, выделенной из клеток опухолей,

также свидетельствуют о существовании онкогенов.

Сокращенные названия клеточных

и вирусных онкогенов

Онкоген, содержащийся в опухолевых клетках,

обычно обозначается в литературе «с-оnе» (от cellular oncogene; например, c-ras). Аналоги, содержа­

щиеся в нормальных клеткаХ,-протоонкогены­

соответственно носят название с-оnе-прото­

онкоген (например, с-rае-протоонкоген). Вирусный онкоген называют у-оnе (например, v-ras; от viral oncogene), а соответствующий протоонкоген­ v-оnе-протоонкоген (например, v-rаs-протоон­ коген).

~еханизм превращения протоонкогенов

в онкогены

Мы обсудим пять механизмов, с помощью кото­

рых меняется экспрессия или структура протоонко­

генов и, следовательно происходит их превращение

в онкоген. Процесс, в результате которого транс­

крипция гена повышается (от нулевого или Низкого

уровня), называют активацией. Знание механизмов

активации принципиально для понимания современ­

ного состояния проблемы канцерогенеза.

А. Вставка промотора. Некоторые ретровирусы (например, вирусы лейкозов птиц) не содержат онКО­ генов, однако способны вызывать рак. При этом опухоли появляются через более длительный проме­

жуток времени (через месяцы, а не дни, как в случае вирусов, содержаших онкогены). При инфицирова­

нии клеток этими вирусами и другими ретровируса­

Метод обнаружения клеточных онкогенов получил

название <<Переноса геиов» или «трансфекции». Он ос­

нован на том, что некоторые гены, присутствующие

вопухолевых клетках, могут вызывать трансформа­ цию «нормальных» клеток в культуре. Из опухоле­

вых клеток выделяют ДИК. осаждают фосфатом ка­ льция и добавляют к клеткам-реципиентам (обычно

вэтой роли выступает линия мышиных фибробла­ стов NIHj3T3). Через 1-2 недели под микроскопом наблюдают образование фокусов трансформации. Клетки, составляющие фокус, меняют свою морфо­

логию: из распластанных они становятся округлен­

ными. Из трансформированных клеток выделяют

ДИК, и опыт повторяют. Так делают несколько раз, при этом уменьшается количество ДИК, не уча­ ствующей впереносе признака трансформации, и, следовательно, облегчается идентификация специ­ фических генов (при помощи гибридизации по Сау­ зерну (см. гл. 36». С помошью этого метода было идентифицировано около 20 клеточных онкогенов;

некоторые из них сходны с геном ra.5 вируса саркомы

мышей. Эти клеточные онкогены либо вообще не от­

личаются от нормальных генов, либо имеют неболь­ шие структурные особенности (см. ниже). В первом

случае при опухолевом перерождении может ме­

няться регуляция их экспрессии.

ми с вирусного РИК-генома с помошью обратной

транскриптазы синтезируется копия ДНК (кДНК), которая встраивается в геном клетки-хозяина. Инте­

грированная двухцепочечная кДИК называется про­ вирусом. Копии кДНК ретровирусов, подобно неко­ торым транспозонам (прыгающим генам), найденным в растениях и бактериях, содержат на обоих концах

последовательности, называемые длинными конце­

выми повторами. Эти последовательности играют

важную роль в механизме интеграции провируса

и действуют как промоторы транскрипции (см. гл. 39). При инфицировании В-лимфоцитов кур некото­

рыми вирусами лейкоза птиц их провирусы встраи­

ваются в районе гена туе. Этот ген активируется ра­

сположенным до него длинным концевым повтором,

выступающим в роли промотора. В результате про­

исходит транскрипция, а затем и трансляции соот­

ветствующей туе-мРИК (рис. 57.3). Это в свою оче­

редь приводит к развитию В-клеточной опухоли,

хотя конкретная роль продуктов гена туе в этом

процессе пока неясна. Сходные процессы происходят

и при инфицировании различных клеток другими ре­

тровирусами.

Б. Вставка ЭRхансера. Иногда провирус встраи­ вается после гена туе или до него, но в обратной

ориентации, тем не менее ген туе активируется (рис.