Sbornik-2014

комбинаций на функцию нейтрофилов крови, а также их репаративной активности в условиях экспериментального перелома бедренной кости.

Опыты проводились на крысах Вистар массой 180-220 грамм, которым под хлоралгидратным наркозом производился закрытый перелом правой бедренной кости с последующей интрамедуллярной фиксацией еѐ спицей [10]. Соответствующую навеску пептида растворяли в 0,1 мл физиологического раствора и в течение 10 дней со дня перелома вводили животным внутрибрюшинно, в эквимолярных дозах Gly-His-Lys (GHL) - 0,5 мкг (синтезирован в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета), Даларгин - 1,2 мкг (Микроген НПО ФГУП, Россия) и Тимоген - 0,5 мкг (МБНПК ЦИТОМЕД ЗАО, Россия) на 1 кг массы тела соответственно. Крысы контрольной группы получали физиологический раствор в эквивалентном объеме в течение того же периода времени. Животных выводили из эксперимента через 10 суток после перелома.

Фагоцитарную активность нейтрофилов крови исследовали после их инкубации с латексом [5,11]. Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов использовали фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ). ФИ (процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе) и ФЧ (среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит) определяли в мазках, окрашенных по Романовскому [5, 11]. В каждом мазке просчитывали 100 нейтрофилов. Так же вычислялся индекс активности фагоцитов (ИАФ) (число фагоцитированных частиц латекса, умноженное на процент фагоцитирующих клеток и разделенное на число подсчитанных клеток) [11]. Процесс консолидации переломов оценивали рентгенологически с использованием диагностического комплекса Dixion Redikom (Россия).

Полученные цифровые данные обрабатывались с помощью встроенных алгоритмов пакета анализа приложения для персонального компьютера. Достоверность различий сравниваемых параметров между средними значениями контроля и других групп животных определяли по перекрытию областей интервалов при р<0,05 и с помощью критерия Манна-Уитни.

Установлено, что при экспериментальном переломе наблюдалось существенное снижение показателей ФИ, ФЧ и ИАФ, что свидетельствовало об ослаблении фагоцитарной активности нейтрофилов крови (таблица 1). В этих условиях все пептиды, введенные по отдельности, повышали процент участвующих в фагоцитозе нейтрофилов ФИ, а также ФЧ и ИАФ по сравнению с контрольной группой, получавшей инъекции физиологического раствора. При этом наибольшей стимулирующей активностью обладал тимоген, о чем свидетельствовало более выраженное повышение ФИ и ИАФ по сравнению с другими пептидами.

261

При использовании комбинаций пептидов наблюдалось усиление эффекта. При этом коррекция изучаемых показателей наблюдалась в группах животных, получавших комбинацию пептидов GHL + тимоген и GHL + даларгин.

Таблица 1 Влияние пептидов Gly-His-Lys (GHL), тимогена и даларгина, а также их

комбинаций на фагоцитарную активность нейтрофилов крови (М±m, n=8) при экспериментальном переломе у крыс.

Примечание: * - достоверность отличий (р<0,05), цифры рядом со звездочкой показывают по отношению к показателю, какой группы эти различия достоверны, n – количество животных в группах.

Таким образом, при переломах трубчатых костей комбинации GHL+даларгин и GHL + тимоген корригировали поглотительную стадию фагоцитоза нейтрофилов крови.

В результате проведенных рентгенологических исследований, было выявлено, что в группах животных, получавших пептиды по отдельности и, особенно, у крыс, получавших комбинации пептидов, линия перелома была менее выражена по сравнению с контролем.

Травма вызывает существенные изменения в процессах иммунной защиты организма. Известно, что при стрессорных воздействиях уменьшается масса тимуса преимущественно вследствие опустошения

262

лимфоидных структур его коркового слоя [3]. В связи с этим, целесообразно применение тимогена в этих условиях, обладающего тимомиметическими иммуномодулирующими свойствами [8]. Повидимому, его комбинация с такими репарантами как даларгин и пептид GHL усиливает репаративную активность благодаря сочетанию непрямого репаративного действия (через иммунную систему) с непосредственным воздействием на клетки костной ткани.

В то же время показано, что стимуляция иммунитета ускоряет сращение переломов [3,6]. В связи с этим, коррекция иммунной функции целесообразна в комплексной терапии многих патологических процессов, в том числе и при переломах [8]. В связи с этим, наличие иммунокорригирующей активности у препарата или фармакологического сочетания, как-правило, позитивным образом сказывается на их репаративном действии.

Учитывая вышеперечисленное, можно заключить, что выбранные для исследования пептиды при экспериментальном переломе обладали синергичным иммуностимулирующим и репаративным действием, поскольку при комбинированном введении препаратов наблюдалось существенное усиление фагоцитарной активности нейтрофилов крови и репаративного действия, по сравнению с использованием препаратов по отдельности.

Таким образом, при переломах трубчатых костей комбинация GHL+даларгин и GHL + тимоген корригируют поглотительную стадию фагоцитоза нейтрофилов, что сопровождается выраженной активацией восстановительных процессов и может быть использовано для стимуляции репаративного остеогенеза.

Список литературы:

1.Акмаев, И.Г. Современные представления о взаимодействиях регулирующих систем: нервной, эндокринной и иммунной // Успехи физиол. наук. – 1996. – Т. 27, №1. – С. 3-20.

2.Алексеева И.Н., Брызгина Т.М., Павлович С.И., Ильчевич Н.В. Печень и иммунологическая реактивность // Киев, 1991. – 168 с.

3.Бердюгина, О.В. Иммунологическое прогнозирование в травматологии и ортопедии / О.В. Бердюгина. - Екатеринбург: ИздатНаукаСервис, 2009. – 251 с.

4.Максакова Е.В. Даларгин в лечении травматических повреждений роговицы. офтальмологический журнал. - 2000. - N 6. - С. 95-97

5.Медведев, А.Н. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза / А.Н. Медведев // Лаб. дело. – 1991. - №2. – С. 19-20.

6.Осадчий, О.Е Нейротензин: физиологические свойства и роль в регуляции функций организма / O.E. Осадчий // Успехи физиолог, наук.

2004. -Т. 35, №2.-С. 3-21.

7.Склянчук Е.Д., Зоря В.И.,. Гурьев В.В, Васильев А.П.

Остеогенные потенции нативного аутогенного костного мозга,

263

индуцированного кристаллическим химотрипсином, при лечении посттравматических нарушений костной регенерации // Травматология и ортопедия России. – 2009. – №1. – С.15-21.

8.Смирнов В.С. Клиническая фармакология тимогена / Ред..– СПб: , 2004. 106 с.

9.Файтельсон А.В., Дубровин Г.М., Гудырев О.С. и др Фармакологическая коррекция экспериментального остеопороза и переломов на его фоне // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. - 2010. - №3 . – С. 47-51.

10.Фрейдлин И.С. Базофилы и тучные клетки / И.С. Фрейдлин, А.А.Тотолян // Клетки иммунной системы. - Т.4. - Спб.: Наука, 2001. - 308 с.

11.Фримель Г. /Иммунологические методы .- М.: Медицина, 1987.-

472 с.

12.Trackhy R.E., Fors T.D., Pickart L., Uno H.// The hair folliclestimulating properties of peptide copper complexes. Results in C3H mice - Ann. N. -Y. Acad. Sci. – 1991. – Vol. 642, №10. – P. 468-469.

264

СПОСОБЫ ПЕПТИДЭРГИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ ФУНКЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ И РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ КОЖИ

Смахтин М.Ю., Дубровин Г.М., Чердаков В.Ю., Фурман Ю.В.

Курский государственный медицинский университет Кафедра биологической химии, кафедра травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии,

Российский государственный социальный университет

Травматизм является одной из важнейших медицинских проблем для большинства стран мира [3]. В связи с этим, выявление новых фармакологических субстанций, в том числе пептидной природы, а также их комбинаций, эффективно стимулирующих заживление кожных ран, попрежнему актуально [1].

Известно, что иммунная система непосредственно участвует в заживлении кожных ран. Нейтрофилы первыми из фагоцитов приходят в очаг воспаления и от их активности существенно зависит длительность раневого процесса [9]. В связи с этим представляется актуальным дальнейшее выявление эффектов пептидных иммуномодуляторов в условиях кожных ран. Одним из таких пептидов является тимоген, состоящий из двух аминокислот (Glu-Trp) и обладающий выраженными тимомиметическими иммуномодулирующими свойствами [8].

Принимая во внимание наличие выраженного болевого синдрома при травмах, также представляется целесообразным выявление эффектов пептидных компонентов стресс-лимитирующей системы организма, а именно энкефалинов, поскольку опиатные рецепторы для них обнаружены в большинстве органов и тканей [7]. Аналогом нативного лейэнкефалина является даларгин, обладающий и репаративным действием [5]. Также известен трипептид Gly-His-Lys (GHL), непосредственно стимулирующий процессы роста и дифференцировки клеток [12].

Втоже время при травмах кожи сочетанное применение регуляторных пептидов разных функциональных групп требует дальнейшего изучения, поскольку вопросы потенцирования или ослабления их эффектов представляют не только теоретический интерес, но и имеют выраженную практическую направленность [1].

Всвязи с этим целью настоящего исследования было выявление эффектов регуляторных пептидов - тимогена, даларгина, Gly-His-Lys и их комбинаций на функцию нейтрофилов крови, а также их репаративной активности в условиях экспериментальной травмы кожи.

Материалы и методы.

Опыты проводились на крысах Вистар массой 180-220 грамм. Раневой процесс моделировали под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно). При этом полнослойные раны стандартного размера (1 см) наносились на холке животных [2]. Соответствующую навеску пептида растворяли в 0,1 мл физиологического раствора и в течение 10 дней со дня

265

(Микроген НПО ФГУП, Россия) и Тимоген - 0,5 мкг (МБНПК ЦИТОМЕД ЗАО, Россия) на 1 кг массы тела соответственно. Крысам контрольной группы вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме в течение того же периода времени. Животных выводили из эксперимента через 10 суток после травмы кожи.

Скорость заживления ран определяли путем динамического измерения площади ран [2]. Сразу после моделирования раневого процесса и через десять дней раны фотографировали цифровой фотокамерой Canon A410 с применением миллиметровой сетки с последующим измерением начальной (1-е сутки) и конечной (через 10 суток) площадей ран. Вычисление площадей ран производилось с помощью программы Image Tool. На основании полученных данных вычислялся коэффициент относительной регенерации ран по формуле: Y= So-St/So, где Y – коэффициент относительного заживления, So – начальная площадь раны, St – конечная площадь раны [2].

Фагоцитарную активность нейтрофилов крови исследовали после их инкубации с латексом [6,10]. Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов использовали фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ). ФИ (процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе) и ФЧ (среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит) определяли в мазках, окрашенных по Романовскому [6]. В каждом мазке просчитывали 100 нейтрофилов. Так же вычислялся индекс активности фагоцитов (ИАФ) (число фагоцитированных частиц латекса, умноженное на процент фагоцитирующих клеток и разделенное на число подсчитанных клеток) [10].

Кислородзависимую активность нейтрофилов определяли по реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) с использованием Multiscan MC 400 (Labsystems, Финляндия) [4]. В качестве стимулятора использовали зимозан. Функциональный резерв нейтрофилов (ФРН) рассчитывали как отношение показателей стимулированнного и спонтанного НСТ-теста [10].

Полученные цифровые данные обрабатывались с помощью встроенных алгоритмов пакета анализа приложения для персонального компьютера. Достоверность различий сравниваемых параметров между средними значениями контроля и других групп животных определяли по перекрытию областей интервалов при р<0,05 и с помощью критерия Манна-Уитни.

Результаты и их обсуждение.

Установлено, что при экспериментальной травме кожи наблюдалось снижение показателей ФИ, ФЧ и ИАФ, что свидетельствовало об ослаблении фагоцитарной активности нейтрофилов крови (таблица 1).

266

Установлено, что в пептид GHL при внутрибрюшинном введении не оказывал существенного влияния на функцию нейтрофилов крови. В этих условиях пептиды даларгин и тимоген в эквимолярных концентрациях сопоставимо стимулировали активность нейтрофилов (ФИ, ФЧ, ИАФ).

Таблица 1 Влияние пептида Gly-His-Lys, тимогена, даларгина и их комбинации на фагоцитарную активность нейтрофилов крови при травме кожи (M±m,

n=8)

Примечание: * - достоверность отличий (р<0,05), цифры рядом со звездочкой показывают по отношению к показателю, какой группы эти различия достоверны, n – количество животных в группах.

При использовании комбинаций пептидов наблюдалось усиление эффекта. При этом в группе животных, получавших комбинацию пептидов GHL+тимоген, наблюдалась коррекция уровня ФИ и ИАФ, а при использовании комбинации GHL+даларгин – коррекция уровня всех изученных показателей (ФИ, ФЧ, ИАФ) (таблица 1).

Травматическое повреждение кожных покровов экспериментальных животных также сопровождалось снижением показателей кислородзависимой бактерицидной активности нейтрофилов и угнетением их функционального резерва . Раздельное введение даларгина и тимогена достоверно усиливало кислородзависимую активность нейтрофилов периферической крови. При комбинированном введении тимогена или даларгина с пептидом GHL, усиление эффекта наблюдалось в обеих

267

группах животных, что сопровождалось коррекцией функционального резерва нейтрофилов.

При изучении репаративной активности пептидов было выявлено, что все они повышали скорость заживления ран (таблица 2). Эффект усиливается при использовании комбинаций GHL+тимоген и GHL+даларгин. Известно, что в фазе воспаления происходит миграция лейкоцитов в рану. В первые 24 часа в ране доминируют нейтрофилы, а позже - макрофаги и лимфоциты [11]. Эти клетки регулируют создание соединительнотканного матрикса формирующегося рубца путем выделения различных цитокинов. От их активности также зависит вероятность нагноения и длительность патологического процесса [9].

В связи с этим целесообразным представляется использование иммуномодулятора тимогена в этих условиях. Возможно, что его сочетание с такими пептидными репарантами как GHL и даларгин усиливает репаративную активность благодаря сочетанию двух эффектов - за счет активации клеток иммунной системы и через нее стимуляции непрямого репаративного действия и непосредственным воздействием на клетки кожи.

Возможно, что тимоген, активируя нейтрофильные гранулоциты, способствует выделению ими ряда пептидных веществ, которые, могут положительно влиять на процессы заживления ран [8].

Таблица 2 Влияние пептида Gly-His-Lys, тимогена, даларгина и их комбинации

на заживление кожных ран (M±m, n=8).

Примечание: * - достоверность отличий (р<0,05), цифры рядом со звездочкой показывают по отношению к показателю, какой группы эти различия достоверны, n – количество животных в группах.

В тоже время, выраженная репаративная активность комбинации GHL+даларгин могла быть обусловлена не только непосредственным действием двух пептидов-репарантов [5,12] на клетки соединительной ткани, но и сочетанием синергичной иммунокорригирующей активности, а также проявлением стресс-лимитирующего действия даларгина [12].

Учитывая выше перечисленное, можно заключить, что выбранные для исследования пептиды в условиях кожных ран обладали синергичными свойствами в отношении иммунной функции и репаративной регенерации, так как при сочетанном (попарном) введении пептидов наблюдалось достоверное увеличение показателей функции нейтрофилов крови и процесса репарации в сравнении с группами раздельного введения препаратов. Наиболее выраженный иммунокорригирующий и репаративный эффекты оказывали комбинации пептидов GHL+тимоген и GHL+даларгин.

Таким образом, в условиях экспериментальной травмы кожи комбинации препаратов GHL+тимоген и GHL+даларгин стимулируют функциональную активность нейтрофилов крови, доводя их до нормальных значений, что сопровождается ускорением процессов восстановления кожных покровов.

Список литературы:

1.Акмаев И.Г. Современные представления о взаимодействиях регулирующих систем: нервной, эндокринной и иммунной // Успехи физиол. наук. – 1996. – Т. 27, №1. – С. 3-20.

2.Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хотинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. – М., 1981. – 157 с.

3. Анкин Л.Н. Политравма: Организационные, тактические

иметодологические проблемы. – М.: Медпресс-информ., 2004.–176 с.

4.Зинкин В.Ю., Годков М.А. Способ количественной оценки кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов человека // Клин. лаб. диагност. – 2004. – №8. – С. 26-29.

5.Максакова Е.В. Даларгин в лечении травматических повреждений роговицы // Офтальмолог. журнал. – 2000. – № 6. – С. 95-97

6.Медведев, А.Н. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза // Лаб. дело. – 1991. – №2. – С. 19-20.

7.Рудин И.В. Влияние даларгина на желчеотделительную функцию печени // Бюллетень сибирской медицины. –2006. – №1. – С.21-25.

8.Смирнов В.С. Клиническая фармакология тимогена. – СПб: Ред., 2004. – 106 с.

9.Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Базофилы и тучные клетки // Клетки иммунной системы. – Т.4. – СПБ.: Наука, 2001. – 308 с.

269

10. Фримель Г. Иммунологические методы. – М.: Медицина, 1987. –

472 с.

11.Martin P., Hopkinson-Wooley J., McCluskey J. Growth factors and cutaneous wound repair // Prog. Growth Factor Res. – 1992. – Vol. 4. – P. 25– 44.

12.Trackhy R.E., Fors T.D., Pickart L., Uno H. The hair folliclestimulating properties of peptide copper complexes. Results in C3H mice // Ann. N. -Y. Acad. Sci. – 1991. – Vol. 642, – №10. – P. 468-469.

270