§ 3. Для диагностики вирусных гепатитов могут быть использованы методы:

А. Для обнаружения вируса - заражение животных (обезьяны шимпанзе, мармозеты; электронная и иммуноэлектронная микроскопия.

Б. Для обнаружения антител к вирусу (или к его антигенам) иммунологические реакции: РСК, гемагглютинация иммунного прилипания, иммунофлуоресценция, иммуноферментный и радиоиммунный методы, реак­ция пассивной гемагглютинации и др.способы.

Наиболее специфичным методом диагностики гепатита А является использование иммуноферментного метода "захвата" антител класса IgМ. Суть метода. На стенках полистироловых луночек вначале адсорбируют антитела против IgM(анти-IgM, затем добавляют исследуемую сыворот­ку, в которой определяют наличие антител класса IgМ к вирусу гепатита А. Если они имеются, то образуется комплекс IgM- анти IgM. Далее добавляют специфический антиген (вирус гепатита А)-который связывается с противовирусными антителами. Для обнаружения образовавшегося комплекса добавляют противовирусные антитела; меченные ферментом (пероксидазой). После отмывания луночек в них добавляют субстрат для фермента (ортофенилендиамин) и определяют интенсивность образу­ющейся окраски. Схема.

Методика постановки реакции обратной пассивной гемагглютинации для определения поверхностного антигена вируса гепатита В

Определение поверхностного антигена вируса гепатита В (HB_SAg) в сыворотке больного или носителя осуществляется с помощью анти-тельного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой лиофилизированные формалинизированные куриные эритроциты с адсорбированными: на них антителами к НВ_sАg.

К содержимому ампулы с сенсибилизированными эритроцитами до­бавляют 5 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида (ФР). Исследуемую сыворотку разводят 1:8. Для этого в лунку планшета вносят при по­мощи пипеточного дозатора 200 мкл ФР, добавляют 25 мкл исследуемой сыворотки крови, перемешивают и 25 мкл приготовленного разведения переносят в пустую луночку планшета. В качестве контрольных образ­цов используют сыворотку заведомо положительную в разведении 1:8 и ФР. В лунки, содержащие по 25 мкл исследуемых проб, добавляют 25-33 мкл 1%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Реагенты переме­шивают постукиванием о край планшета в течение 30 ,сек и выдерживают 20-30 мин при комнатной температуре. Результаты РОПГА считают отри­цательными при отсутствии гемагглютинации с исследуемой сывороткой и ФР, но при наличии ее в заведомо положительной пробе. Все сыворот­ки, агглютинирующие сенсибилизированные эритроциты, исследуют в под­тверждающем тесте. Суть его состоит в том, что в лунках планшета готовят два ряда двукратных разведений исследуемой сыворотки крови от 1:2 до 1:256 в объемах по 25 мкл. В контрольный ряд добавляют несенсибилизированные эритроциты. Планшеты с разведениями выдер­живают не менее 30 минут при комнатной температуре, а затем добавляют в оба ряда по 25-33 мкл сенсибилизированных эритроцитов. Ре­зультаты реакции считают положительными, если в опытном ряду наблюдается по крайней мере 4-х кратное снижение титра исследуемой сыворотки.

А. ВИРУСНЫЕ ГЕПАТИТЫ

Известны следующие формы вирусных гепатитов:

1.Гепатит А (инфекционный гепатит).

2.Гепатит В (сывороточный гепатит).

3.Гепатит-дельта - эпидемиологически сходен с гепатитом В, но вызывается дельта-вирусом.

4.Гепатит С (гепатит ни А ни В) - заражение происходит главным образом парентеральным путем, но возбудитель отличается от вирусов А и В.

5.Гепатит Е (гепатит ни А ни В) - заражение происходит, как при гепатите А, главным образом фекально-оралъным путем, но возбу­дитель отличается от вирусов А и В.

Вирус гепатита А - изометрический РНК-содержащий вирус. Геном представлен однонитчатой позитивной РНК с м.м. 2,6 млн. Диаметр вириона 27 нм, суперкапсида нет, тип симметрии кубический, икосаэдр. Капсид имеет 32 капсомера Оболочка образована 4 полипептидами.

Возбудитель гепатита В - ДНК-содержащий сферический вирус. Диаметр вириона 42 ны. Геном представлен двунитчатой кольцевидной ДНК с м.м. 1,6 млн; одна нить имеет брешь. Вирион содержит обратную транскриптазу, принимающую участие в репликации. С ее участием происходит синтез на прегеномной РНК вначале минус, а затем плюс-цепей ДНК, в составе генома только четыре гена: S,С,Р и X. Оболочка вириона состоит из трех белков (главного, большого и среднего). Схему строения вириона см. на стр.124.

В составе вириона имеется три основных антигена: НВSАg-поверхностный антиген; 2)НВсАg - сердцевинный и 3) антиген НВeАg.

Возбудитель дельта-гепатита имеет сферическую форму с диаметром З5-37 нм.

Геном представлен РНК с м.м. 500000. Внешняя оболочка вириона состоит из поверхностного антигена вируса гепатита В (НВ_SАg), а при ее разрушении выделяется компонент со специфической антигенностью (дельта-антиген).

Б. Культивирование вирусов гепатитов удается с большим трудом и требует соблюдения ряда условий. В нашей стране разработан метод культивирования вируса гепатита А в культуре клеток 4647 (перевиваемая линия клеток почек зеленых мартышек).

В. Для профилактики гепатита А создаются различные вакцины:

1.Цельновирионные из ослабленных или инактивированных (формоловые) вирусов вакцины.

2.Субвирионные вакцины.

3.Вакцины химические (из химических аналогов антигенных детерминант вируса).

4.Генно-инженерные вакцины (гены вируса гепатита А рекомбинированы в геном вируса осповакцины).

Одним из важных условий борьбы с гепатитом В в глобальном пла­не, по мнению ВОЗ, является массовая иммунизация новорожденных и детей раннего возраста. Полный курс иммунизации против гепатита В состоит из трех прививок: первая доза вводится сразу после рождения, вторая через 1-2 месяца и третья - до конца первого года жизни ребенка.

Для вакцинации против гепатита В применяется два типа высоко эффективных вакцин: плазменная вакцина (плазма хронических носителей вируса содержит огромное количество поверхностного антигена ви­руса гепатита В, он извлекается и надежно обезвреживается) и реком-бинантная генно-инженерная вакцина, которая готовится на основе рекомбинантного клона дрожжей, несущего гены НВsАg.

ЗАНЯТИЕ 5

Дата___________________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА СИНДРОМА ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (СПИДа)

План занятия

1.Особенности структурной организации вируса и его генома.

2.Механизм взаимодействия вируса СПИДа с клеткой, особенности патогенеза инфекции.

3.Вирусологическая диагностика ВИЧ-инфекции.

4.Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции:

а)определение противовирусных антител у больных и носителей с помощью коммерческих тест- систем; демонстрация;

б)метод иммуноблотинга и его значение.

5.Знакомство с иммунопрепаратами, применяемыми для диагностики, профилактики и лечения вирусных заболеваний. Обязательные прививки против кори, полиомиелита и гепатита В.

Методические указания

§ I. Вирус СПИДа (ВИЧ) имеет шаровидную форму, его диаметр 100 нм. Оболочка вируса имеет форму многогранника, составленного из 12 пятиугольников и 20 шестиугольников. В центре и углах каждого шестиугольника расположены молекулы gp120 (всего 80 молекул на вирион), оболочка содержит двойной слой липидов, над которыми выступают молекулы gp120, а через мембрану проходит трансмембранный белок gр41.

Сердцевина вириона имеет форму снаряда, составляющие его моле­кулы из трех-четырех белков образуют поверхность в виде дельта-ико­саэдра.

Белок gp120 является рецептором вируса, взаимодействующим с рецептором СД4 чувствительных к нему клеток (Т- лимфоциты, макрофаги, моноциты).

В сердцевине вириона содержится его геном. Он представлен двумя идентичными молекулами РНК (у ВИЧ-1 из 9213 нуклеотидов), двумя молекулами затравочной РНК, двумя молекулами полимеразы, обладающей пятью активностями (протеазной, обратной транскриптазы, РНК-азы, ДНК-зависимой ДНК-полимеразы и эндонуклеазы, или интегразы). РНК связана с нуклеокапсидным белком.

Особенности организации генома

ДНК провируса (ВИЧ-1) состоит из 9283 нуклеотидных пар (н.п.) и фланкирована LTR из 638 н.п.

В составе генома (ДНК-провируса) девять генов, которые контро­лируют синтез 8 структурных и 6 регуляторных белков:

gag - p17, р30, р15 - эти белки образуют сердцевину вириона;

роl - р12 (протеаза). р51 - p66 (обратная транскриптаза , РНКаза Н, ДНК-зависимая ДНК-полимераза), р32 (интеграза, или эндонуклеаза);

env- белки оболочки (gp120, gp41).

Указанные восемь белков входят в состав вириона.

Регуляторные гены и белки

tat - pI4 (TAT); vif - р23 (VIF);

rev - pI2 (REV); vpu - pI6 (VPU);

nef - p27 (NEF); vpr - (VPR).

Таким образом, девять генов вируса кодируют синтез 14 белков. Это связано с тем, что некоторые гены имеют экзонно-интронную структуру и имеют несколько рамок считывания.

Схематическое расположение генов вируса можно изобразить следующим образом:

5`-LTR-gag-pol-vif-tat-rev-env-nef-vpu-vpr-3`-LTR

Сложность работы генома вируса связана с наличием в LTR спе­циальных регуляторных элементов:

а)сигнал транскрипции;

б)сигнал добавления поли-А,

в)сигнал интеграции

г)элемент позитивной регуляции (TAR)

д)элемент негативной регуляции (NRE)

е)область промотора (ТАТАА).

Кроме того, обнаружены элементы, участвующие в регуляции сплайсинга РНК (CRS - стимулирует сплайсинг) и CAR (ингибирует сплайсинг при наличии белка REV ), и элемент Psi , который контро­лирует упаковку геномной РНК в капсид. В LTR имеются элементы, ко­торые определяют участок прикрепления затравочной РНК (тРНК л из ) для синтеза минус-цепи ДНК и участок, служащий затравкой для синтеза плюс-цепи ДНК.

В регуляции вируса особенно важную роль играют белки ТАТ (позитивный контроль размножения вируса через участок TAR), и NEF и VPU-негативный контроль репродукции вируса (через участок NRE) и белок REV (позитивно-негативный контроль через участок CAR). Белок REV контролирует экспрессию генов gag pol env и осуществляет негатив­ную регуляцию сплайсинга.

Таким образом, размножение вируса СПИДа находится под сложным тройным контролем - позитивным, негативным и позитивно-негативным .

§ 2. Взаимодействие вируса с клеткой протекает по следующей схеме: - адсорбция вируса - окаймленная ямка - окаймленный пузырек-лизосома - слияние мембран - выход нуклеокапсида в цитоплазму -син­тез обратной транскриптазой минус-цепи ДНК - разрушение РНК-азой Н вирионной РНК - синтез ДНК-полимеразой плюс-цепи ДНК-образование LTR-проникновение ДНК-провируса в ядро (в хромосому с помощью интегразы). Активация вируса-синтез полноразмерных и субгеномных РНК клеточной РНК-полимеразой - протеолиз и процессинг env- белков -синтез других белков - ассоциация двух молекул геномной РНК с кап-сидными белками - включение двух молекул РНК (а также двух молекул затравочной тРНК и pol- белков) в капсид - мембрана клетки - липидная оболочка - белки gp4I и gpI20 - отпочкование вирионов - образо­вание симпластов из Т-лимфоцитов - их гибель - иммунодефицит - нарушение других систем - присоединение оппортунистических инфекций.

Заражение вирусом - начало вирусоносительства. Активация Т-лимфоцита (и, соответственно, вируса) - начало болезни.

§ 3. Вирусологический диагноз ВИЧ-инфекции трудно осуществим, так как животные к вирусу не чувствительны, а вирус размножается только в одном клоне лимфоцитов (Н9), которых лаборатории не имеют. Наличие вируса или его антигенов можно обнаружить с помощью некоторых иммунологических реакций, но для этого требуются специфические антитела, получение которых связано с большими трудностями. В принципе, возможно использование также метода РНК-зонда.

4. Основным способом диагностики ВИЧ-инфекции и особенно выявления вирусоносительства является использование метода иммуноферментного анализа. Имеющиеся коммерческие тест-системы просты в употреблении, содержат сенсибилизированные антигеном лунки в планшетах, все необходимые ингредиенты и контроли. В силу своей универсальности этот метод получил повсеместное применение. Демонстрация отечественных тест-систем для иммуноферментного определения антител к вирусу СПИДа. Постановка опыта (методика опыта описана в занятии 11).

§ 5. Недостатком иммуноферментного метода является то, что нередко он дает ложнопозитивные результаты. Поэтому в случае сомнения такая сыворотка подвергается контрольному испытанию более чувствительными специфичными методами, например с помощью метода иммуноблотинга или иммунопреципитации.

Метод иммуноблотинга представляет собой тестирование твердо-фазным иммунологическим анализом электрофоретически разделенных белков. Реакция ставится в следующей последовательности: электрофоретическое разделение анализируемого материала на индивидуальные белки или полипептиды в геле; получение реплики путем переноса исследуемых белков с геля на твердофазный матрикс; блокирование незанятых центров связывания белков матрикса; инкубирование со специфической тест-сывороткой; отмывка от избытка сыворотки; инкубирование с меченым иммунореагентом на антитела специфической сыворотки; отмывка от избытка меченого иммунореагента; выявление тестируемых белков или полипептидов с помощью метки иммунореагента.

Для разделения анализируемого материала используют чаще всего различные варианты электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ).

После электрофоретического разделения белков их иммобилизуют на твердой фазе (матриксе), в качестве которой в основном применяют нитроцеллюлозные мембраны (НЦМ). На ПААГ помещают НЦМ и проводят электрофоретический перенос в перпендикулярном к гелю направлении.

На полученной нитроцеллюлозной реплике блокируют активные центры связывания во избежание неспецифической адсорбции реагентов. С этой целью НЦМ инкубируют с раствором бычьего сывороточного альбумина в концентрации 2-5% в течение 1-2 часов.

После блокирования активных мест связывания НЦМ инкубируют с эмпирически подобранным разведением специфической сыворотки (т.е. заведомо положительной сывороткой), причем время инкубирования изменяется в широком диапазоне в зависимости от авидности компонентов. Обычно инкубирование в течение двух часов при 37° или в течение ночи при 4° дает хорошие результаты. НЦМ несколько раз отмывают блокирующим раствором от неспецифически адсорбированной сыворотки и тестируют специфические антитела одним из методов твердофазного иммунного анализа, чаще всего используют ИФМ или РИМ. В том и другом случае НЦМ после обработки специфической сывороткой инкубируют с меченными ферментом антивидовыми антителами, в качестве метки используют пероксидазу хрена (ИФМ) либо радиоактивный йод (РИМ).

После отмывки физиологическим буфером избытка меченых антител на заключительном этапе проведения иммуноблотинга выявляют тестируемые антитела по ферментативной реакции с соответствующим субстратом или авторадиографическим методом.

Контрольные вопросы по вирусологии

Что собой представляют вирусы, являются ли они живыми существами или неживыми структурами?

Каким образом происходит проникновение вируса в клетку?

Какие вакцины применяют для профилактики гриппа? Чем отличаются вирусы от всех прочих живых существ?

Рис.1 СХЕМА СТРОЕНИЯ ВИРИОНА ВИРУСА СПИДа

Каким способом происходит заражение вирусом гепатита В? Какие формы вирусных гепатитов Вы знаете?

С какой целью производится фаготипирование бактерий, например, стафилококков?

Какие методы культивирования вирусов Вы знаете и какие методы их типирования применяются?

Что собой, представляют аденовирусы и какие наиболее характерные признаки проявления аденовирусной инфекции?

Какие вирусы являются возбудителями острых респираторных заболе­ваний (ОРЗ)?

Каким образом происходит заражение человека вирусом иммунодефицита?

По каким признакам можно судить о размножении вирусов в культуре клеток?

Какие клетки организма поражает вирус иммунодефицита и какой рецептор имеют эти клетки?

В чем заключается сущность иммуноферментного метода (ИФМ) диагностики инфекционных заболевании?

Сколько типов вирусов гепатита Вы знаете?

Какие серологические реакции применяются для диагностики гриппа?

Какие серологические реакции можно использовать для диагностики вирусных инфекций?

Какие вирусы вызывают острые кишечные заболевания (ОКЗ)?

Из каких основных этапов складывается процесс взаимодействия вируса с клеткой?

Какие типы вирусных геномов Вы знаете?

Чем характеризуются арбовирусы? Какие типы флавивирусов вызывает клещевой весенне-летний энцефалит и омскую геморрагическую лихорадку?

Каковы методы микробиологической диагностики клещевого энцефалита?

Из каких структурных компонентов состоят вирусы? Что такое капсид? Нуклеокапсид? Какие типы их симметрии Вы знаете?

Изменение каких наружных белков вируса гриппа приводит к появлению пандемических вариантов его и почему?

Как устроен вирус гриппа? Каковы особенности его генома?

Какая вакцина применяется в нашей стране для создания активного коллективного иммунитета против полиомиелита?

В каком возрасте делают прививки против полиомиелита?

Каким образом можно выделить от больного гриппом возбудителя и установить его серотип?

Как устроен вирус полиомиелита и каковы способы заражения этим возбудителем?

Как устроен вирус иммунодефицита человека?

Сколько генов имеет вирус иммунодефицита и какие белки они контролируют?

Какие регуляторные элементы содержатся в длинных концевых повторах (LTR) генома вируса иммунодефицита?

Каков механизм развития иммунодефицита человека в результате заражения его возбудителем?

Какие методы применяются для диагностики вирусного гепатита А?

Какая иммунологическая реакция применяется для обнаружения поверхностного антигена (HBsAg) вируса гепатита В у больных и вирусоносителей?

Какие вакцины используются для создания активного коллективного иммунитета против гепатита В?

Что собой представляет возбудитель дельта-гепатита?

Чем характеризуется возбудитель гепатит А?

Как устроен вирус - возбудитель гепатита В? Какую роль играет содержащаяся в вирионе обратная транскриптаза?

Каковы особенности размножения ретровирусов, почему они получили такое название?

Какие механизмы лежат в основе противовирусного иммунитета?

Как распознают Т-киллеры клетки, инфицированные вирусом?

Какую роль играют в патологии человека вирусы Коксаки и ЕСНО?

Каковы методы диагностики заболеваний, вызываемых энтеровирусами?

Почему для диагностики вирусного гепатита А наиболее приемлемой является методика "захвата" антител, относящихся к иммуноглобулинам класса IgM?

Какие Т-лимфоциты обеспечивают защиту организма от вирусов?

С помощью какой серологической реакции можно определить наличие вируса иммунодефицита в организме человека и в чем сущность этой реакции?

Что такое иммуноблотинг и для какой цели он применяется?

Почему лица, пораженные вирусом иммунодефицита, становятся легко восприимчивыми к различным, даже слабо патогенным, микроорганизмам, иначе говоря,почему у них часто развиваются оппортунистические инфекции?

Какие типы симметрии известны у вирусов?

Как проникает в организм вирус гриппа и из каких основных этапов складывается процесс его внутриклеточного размножения?

Каково значение гемагглютининов вируса гриппа?

Каков механизм противовирусного действия интерферона? Как происходит заражение гепатитом В?

Какие клетки поражает вирус иммунодефицита человека и как он распознает их, т.е. какие рецепторы содержат эти клетки для вируса?

Что такое лизогения и лизогенная конверсия и какими фагами она вызывается - вирулентными или умеренными?

Каковы механизмы персистирования вирусов в организме человека?

Каким образом бактериофаг может изменить генетические свойства бактерий?

Что такое первично-трипсинизированные культуры клеток и перевиваемые культуры клеток?

Каким образом РНК-содержащие вирусы могут интегрировать в хромосому клетки?

Каким образом онкогенные вирусы вызывают трансформацию нормальных клеток в злокачественные? Что такое протоонкоген и онкоген?

Почему вирусы являются облигатными паразитами?

Как устроен вирус дельта-гепатита? Какой нуклеиновой кислотой представлен его геном?

Каков механизм реакции торможения гемагглютинации?

Из каких основных этапов складывается процесс взаимодействия вируса СПИДа с клеткой?

Какие типы антигенной изменчивости вируса, гриппа Вы знаете и каково их значение в эпидемиологии этой болезни?

Каков механизм формирования вириона гриппа в клетке?

Как осуществляется специфическая профилактика бешенства и какие препараты применяются для этой цели и в каких случаях?

Как осуществляется микробиологическая диагностика бешенства?

Как устроены аденовирусы, чем представлен их геном, какой тип симметрии имеет вирион и сколько у него капсомеров?

Каковы особенности репликации вирусов, у которых геном представлен однонитчатой ДНК?

о Каковы особенности репликации вирусов, у которых геном представлен однонитчатой РНК?

Какая разница между позитивными и негативными вариантами однонитчатых РНК-геномов?

В чем заключается сущность радиоимиунного метода (РИМ) диагностики инфекционных заболеваний?

Рис.2 Структура вириона HBV

Рис.3 Геном HBV