- •Часть I
- •§ I. А) Оборудование рабочего места.
- •§ 7. Метод люминесцентной микроскопии.
- •§ I. Устройство электронного микроскопа.
- •§2. Методы электронно-микроскопического препарирования.
- •§3. Методы получения ультратонких срезов
- •§ 4. Демонстрация ультратонких срезов бактериальных клеток в электронном микроскопе.
- •§ 5. Описание метода микроскопии в темном поле см. В методических указаниях к 4 практическому занятию.
- •§ 2. Посмотреть под микроскопом препарат-мазок из культуры бактерий, имеющих жгутики, и зарисовать. Препарат окрашен по методу Бениньетти.
- •§ 3. Окраска по Граму (в модификации Синева) производят следующим образом. Из исследуемого материала готовят тонкий препарат-мазок, высушивают его на воздухе и фиксируют на пламени спиртовки.
- •§ 4. Окраска зерен волютина по Нейссеру.
- •§ 5. Окраска капсул по методу Бурри-Гинса.
- •§ 3. Метод микроскопии в темном поле.
- •§ 6. В препарате-мазке, окрашенном метиленовым синим, обратить внимание на форму дрожжевых клеток, наличие почковидных выпячиваний, а также на внутреннее строение клеток.
- •3Анятие 5
- •§ 9. Сделать посев отпечатков пальцев руки на пластинки мпа и среды Эндо.
- •§ 4. Результаты посева на среды пестрого ряда зарегистрировать в таблице.
- •§ 5. Приготовить взвесь почвы в Физиологическом растворе. С помощью пастеровской пипетки засеять 1-2 капли взвеси на среду Тароцци.
- •§ 4. А) Определение дифтерийного экзотоксина реакцией преципитации в агаре.
- •§ 7. Демонстрация различных методов заражения экспериментальных животных:
- •§ I. Макроскопическое изучение культур стафилококков на кровяном мпа. Зарисовать картину гемолиза.
- •§ 2. Демонстрация инструментария, посуды, разбор правил пересылки материала для исследования в бактериологические лаборатории.
- •§ 5. Опыт действия лизоцима на Micrococcus lysodeikticus.
- •§ I. Определение ld50 по методу Рида и Менча. Ld50 - количество микроорганизмов (бактерий, вирусов), вызывающих гибель 50 % зараженных животных.
- •§ 3. Приготовить корпускулярные антигены из культур водного вибриона и кишечной палочки. Для этого:
- •§ 4. Методы иммунизации животных и получения иммунных сывороток:
- •§ 5. Реакция агглютинации:
- •§ I. Разбор методов приготовления 0- и н-антигенов.
- •§ 5. Определение титра агглютинирующей сыворотки. Для опыта необходимо иметь:
- •§ I. Учесть окончательный результат реакции агглютинации и определить титр испытуемой агглютинирующей сыворотки. Результаты опыта отметить в таблице, схема которой дана ниже.
- •§ 5. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:
- •§ 6.Реакция преципитации в агаре.
- •§2. Реакция лизиса.
- •§ 4. Реакция фагоцитоза. Постановка опсоно-фагоцитарной реакции.
- •§5. А)Прямой иммунофлуоресцентный метод.
- •§ I. А). Опыт трансдукции.
- •Часть II. Вирусология
- •§ I. Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.
- •§ 2. Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Графа. Сущность этого метода состоит в следующем.
- •§ 3. А). Элементарные тельца (вирионы) вируса оспы (тельца Пашена) в препаратах, окрашенных по Морозову, выглядят в виде мелких точек круглой или удлиненной формы, темно-коричневого цвета.
- •§ 4. Методы заражения животных разнообразны: внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, интраназальный, заражение в мозг и другие.
- •§ 6. С помощью камеры Горяева подсчитают количество клеток в 1 мл. Клетки считают по всей камере под малым увеличением микроскопа . Количество клеток в 1 мл вычисляют по формуле:
- •3. Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний
- •3Анятие 3
- •1. Вирусологические:
- •2. Эпидемиологические:
- •§ 3. Для диагностики вирусных гепатитов могут быть использованы методы:
- •Часть III
- •§1.Зарегистрировать в таблице результаты реакции Райта. Сформулировать и записать вывод: указывают ли результаты реакции на наличие заболевания бруцеллезом у данного больного?
- •§5.Рассмотреть невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа колонии сибиреязвенных палочек (вакцинный штамм сти).
- •§ 2,3. Поставить реакцию агглютинации с монорецепторными 0- и н-сыворотками, принимая во внимание биохимические свойства выделенной культуры. Результаты зарегистрировать в тетрадь.
- •§ 1. Произвести макро- и микроскопическое исследование подозрительных колоний (бесцветные, прозрачные). Посеять подозрительную колонию на скошенный мпа и среды "пестрого ряда".
- •§ 1. Поставить реакцию агглютинации на стекле выделенной культуры кишечной палочки с поливалентными ок-сыворотками:
- •§1. Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Тароцци, Вильсон-Блера, Цейсслера, на молоке.
- •§1. Промикроскопировать готовые препараты-мазки из культуры коклюшной палочки с окраской по Граму и зарисовать.
- •§2. Разбор методов микробиологической диагностики коклюша: бактериологического и серологического. Дифференциация коклюшной и паракоклюшной палочек.
- •§2. Промикроскопировать готовые препараты-мазки туберкулезных бактерий, окрашенных по Цилю-Нильсену. Препараты зарисовать.
- •§3. Демонстрация роста туберкулезных бактерий на глицериновом бульоне, яичной среде Петраньяни и других средах.
- •§7. Ознакомление с составом и назначением следующих иммунопрепаратов: туберкулин Коха, очищенный туберкулин ррd-l, вакцина бжп.
- •§1. Произвести учет результатов определения биохимической активности коринебактерий и пробы на токсигенность.
- •§1. Промикроскопировать и зарисовать готовые препараты-мазки риккетсий. По Романовскому-Гимза риккетсии окрашены в красный цвет.
- •§2. Разбор и демонстрация реакции агглютинации с риккетсиозным антигеном (взвесь убитых формалином риккетсий). Результаты реакции зарегистрировать.
§ 4. Демонстрация ультратонких срезов бактериальных клеток в электронном микроскопе.
§ 5. Описание метода микроскопии в темном поле см. В методических указаниях к 4 практическому занятию.
Рис.2 Схема приготовления стеклянных ножей а)насечки для получения квадратов; б)насечка по диагонали; в)готовый нож.
Рис.3 Схема работы ультрамикротома 1.Объект 2.Блок 3.Нож 4.Ультратонкие срезы 5.Ванночка ножа, наполненная дистиллированной водой, на поверхности которой собираются ультратонкие срезы. 6. Лезвие ножа.
Фазовоконтрастная микроскопия.
Обыкновенные окрашенные препараты поглощают часть проходящего через них света, в результате чего амплитуда световых волн снижается и частицы препарата выглядят темнее фона. При прохождении света через неокрашенный препарат амплитуда световых волн не меняется, происходит лишь изменение фазы световых волн, прошедших через частицы препарата. Однако человеческий глаз улавливать это изменение фазы света неспособен, поэтому неокрашенный препарат при правильной установке освещения в микроскопе будет невидим.
Фазоконтрастное устройство позволяет превратить изменение фазы лучей, прошедших через частицы неокрашенного препарата, в изменения амплитуды, воспринимаемые человеческим глазом и, таким образом, позволяет сделать отчетливо видимыми неокрашенные препараты.
Приспособление для фазовоконтрастной микроскопии включает в себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, обеспечивающих освещение препарата полным конусом света, и фазовоконтрастные объективы, которые отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца, вызывающая сдвиг фазы проходящего через нее света. Установка освещения производится таким образом, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, прошел в дальнейшем через расположенное в объективе фазовое кольцо.
При рассмотрении препарата весь свет, прошедший через участки препарата, в которых нет каких-либо объектов, пройдет через фазовое кольцо и даст светлое изображение фона. Свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки,получит некоторые изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча - недифрагированный и дифрагированный. Недифрагированный свет пройдет в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе и получит дополнительный сдвиг фазы. Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция дифрагированного и недифрагированного лучей. Так как эти лучи идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение и уменьшение амплитуды. Благодаря этому микробные клетки будут выглядеть на светлом фоне темными.
Техника фазовоконтрастной микроскопии. Фазовый конденсор вставляют в микроскоп на место обычного, а в револьвер ввинчивают фазовые объективы. Диск револьвера конденсора поворачивают таким образом, чтобы в его окне появилась цифра "О".
Осветитель ставят на планку, соединяющую его с микроскопом. На поверхность плоского зеркала кладут белую бумагу и патрон осветителя вдвигают или выдвигают таким образом, чтобы на бумаге появилось четкое изображение спирали лампы осветителя. Убирают бумагу, закрывают диафрагму конденсора и поворачивают зеркало так, чтобы изображение нити лампы проецировалось на эту диафрагму, после чего полностью открывают диафрагму конденсора.
На столик микроскопа ставят препарат и фокусируют на него слабый сухой объектив. Не трогая наводки микроскопа, поднимают или опускают конденсор, чтобы получить резкое изображение диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Вращением зеркала приводят изображение диафрагмы осветителя в центр поля зрения микроскопа и максимально суживают диафрагму осветителя.
Наводят на препарат фазовый объектив, с которым желают работать. Подниманием или опусканием конденсора добиваются наиболее резкого изображения диафрагмы осветителя, а вращением зеркала уточняют ее центрировку по отношению к краям поля зрения. После этого открывают диафрагму осветителя так, чтобы ее изображение вышло за пределы поля зрения.
Вместо окуляра вставляют в тубус микроскопа вспомогательный микроскоп. Выдвигая трубку вспомогательного микроскопа, добиваются четкой видимости фазового кольца объектива и закрепляют фокусировку вспомогательного микроскопа боковым винтом.
Не трогая макро- и микровинта микроскопа, поворачивают револьвер конденсора так, чтобы в его окошке появилась цифра, соответствующая увеличению применяемого объектива. При этом во вспомогательном микроскопе становятся видны два кольца - темное фазовое кольцо объектива и светлое кольцо диафрагмы конденсора. С помощью центрировочных винтов, расположенных по бокам конденсора, добиваются полного наложения друг на друга этих двух колец. Затем вынимают из тубуса вспомогательный микроскоп, вставляют на его место окуляр и приступают к наблюдению препарата. При работе с фазовоконтрастным микроскопом под конденсором рекомендуется помещать зеленый светофильтр, значительно улучшающий качество изображения.
Б. Морфология микроорганизмов
§ I. Приготовить препараты-мазки из культур: а) стафилококка, стрептококка, сарцины (кокковые формы); б) монобактерии, стрептобациллы (палочковидные формы); в) вибриона (извитая форма) Окрасить их фуксином Пфейффера, промикроскопировать и зарисовать. Обратить внимание на форму и взаиморасположение бактерий в каждом препарате.