Работа № 2. Определение протеолитической активности трипсина

Обоснование выполнения работы. Протеолитический фермент трипсин осуществляет расщепление пищевых белков в содержимом двенадцатиперстной кишки в верхних отделах тонкого кишечника. Фермент используется также для расщепления белков в лабораторных условиях.

Принцип метода. Протеолитическая активность трипсина регистрируется по количеству освобождающегося аргинина и лизина, которые с фенольным реактивом дают синюю окраску, измеряемую колориметрически.

Ход работы: взять две центрифужные пробирки: контрольную и опытную.

ОТМЕРИТЬ	КОНТРОЛЬ	О П Ы Т
Раствор белка Фосфатный буфер рН 8,0 ТХУ, 10 % Раствор трипсина	0,5 мл 1,0 мл 2,0 мл 0,5 мл	0,5 мл 1,0 мл - 0,5 мл
Инкубация 20 минут, при 37оС в термостате
ТХУ, 10 %		2 мл
Центрифугирование 10 минут, 1500 об/мин. Центрифугат перелить в сухие пробирки.
раствор NaOH 0,5 М фенольный реактив	5,0 мл 0,5 мл	5,0 мл 0,5 мл
Размешать. Инкубация 20 минут при 18оС

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

Дата: _______________

Занятие № 5 работа № 1. Влияние температуры на активность амилазы

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Позволяет охарактеризовать одно из свойств ферментов – зависимость протекания ферментативных реакций от температуры (термолабильность).

Принцип метода:

амилаза амилаза

Крахмал декстрины  мальтоза.

Крахмал дает с иодом синий цвет.

Декстрины дают с иодом фиолетовое, красно-бурое окрашивание.

Мальтоза – желтый (цвет иода в воде).

ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки, опыт 1-3. Развести слюну 1 : 10 (1мл слюны в отдельной пробирке + 9 мл Н₂О).

ОТМЕРИТЬ	ОПЫТ-1	ОПЫТ-2	ОПЫТ-3
Крахмал 1 % Амилаза слюны (разведение 1:10)	0,5 мл 0,5 мл	0,5 мл 0,5 мл	0,5 мл 0,5 мл
Поместить пробирки на 10 минут	Комнатная температура (20оС)	Термостат (40оС)	Кипящая водяная баня (100оС)
Через 10 минут во все пробирки добавить по 1-2 капли KJ 1%

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Работа № 2. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Активаторы и ингибиторы регулируют действие ферментов. Эти сведения используют для изучения влияния ксенобиотиков и изучения воздействия на энзимы изменяющихся концентраций нормальных метаболитов клетки.

Принцип метода. При активации идет конформационная перестройка активного центра фермента и увеличивается скорость реакции. Ингибиторы оказывают противоположное действие (механизмы различны: через аллостерический центр, путем ковалентного связывания, денатурации и т.д.).

ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: контрольную и две опытные.

ОТМЕРИТЬ	КОНТРОЛЬ	ОПЫТ 1	ОПЫТ 2
Н2О NaCl 1 % CuSO4 1 % Амилаза слюны (1: 10) Крахмал 1%	10 капель - - 20 капель 5 капель	8 капель 2 капли - 20 капель 5 капель	8 капель - 2 капли 20 капель 5 капель



Пробирки оставить при комнатной температуре на 5 минут

(10, 15 минут).



Добавить по 2-3 капли раствора йода во все пробирки.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД: