Исследование микрофлоры поверхности рыбы

К поверхности исследуемой рыбы прикладывают профламбированное предметное стекло и прижимают его в течение 1 мин. Стекло осторожно снимают, подсушивают, готовят фиксированный препарат и окрашивают по методу Грамма. Готовый мазок просматривают под микроскопом с иммерсионным объективом в тридцати полях зрения.

Исследование микрофлоры внутренних тканей рыбы

В теле рыбы стерильным скальпелем делают надрез, осторожно вводят в него предметное стекло. С одной стороны стекло вытирают фильтровальной бумагой, мазок на другой стороне стекла сушат, фиксируют, окрашивают по Граму. Препарат просматривают в тридцати полях зрения под микроскопом с иммерсионным объективом.

Из глубины мышц также берут мазок-отпечаток. Для этого кожу посередине спины рыбы освобождают от чешуи и прижигают раскаленным скальпелем. Стерильными ножницами и пинцетом вырезают кусочек мяса на глубине 1–1,5 см общей площадью 2 см². Вырезанным кусочком делают несколько отпечатков. На предметное стекло кусочек прикладывают разными гранями на 1 мин. Препарат сушат, фиксируют, окрашивают по методу Грама и просматривают под микроскопом с иммерсионным объективом в тридцати полях зрения.

Из каждой пробы рыбы необходимо приготовить не менее двух мазков-отпечатков.

При микроскопировании в каждом просмотренном поле зрения подсчитывают отдельно число клеток бактерий (кокков и палочек) и дрожжей; результатом является среднее значение общего количества клеток по тридцати полям зрения. Отмечают также наличие или отсутствие в поле зрения микроскопа следов распада мышечной ткани.

Результаты микроскопирования оценивают в соответствии с данными, представленными в табл. 12.

Таблица 12 - Оценка результатов бактериоскопического анализа рыбы

Характеристика рыбы	Микроскопическая картина
Свежая	Отсутствуют микробные клетки или видны единичные кокки и дрожжи (до 10 клеток); следов распада мышечной ткани нет
С частично измененной свежестью	Не более 30 кокков, дрожжей или палочковидных клеток; заметны следы распада мышечной ткани (ядра мышечных волокон в состоянии распада, исчерченность мышечных волокон слабо различима)
Несвежая	Более 30 микробных клеток с преобладанием палочковидных форм; наблюдается значительный распад мышечной ткани, почти полное исчезновение ядер и исчерченности мышечных волокон

Бактериологическое исследование Бактериологический метод заключается в выделении и идентификации чистой культуры возбудителя (популяции).

Рыбу-сырец исследуют на общую микробную обсемененность, содержание бактерий группы кишечных палочек, присутствие сальмонелл, бактерий группы протея, энтерококков.

При бактериологическом исследовании каждую пробу освобождают от жировой и соединительной тканей, погружают в спирт, затем вырезают стерильными ножницами из глубины различных мест кусочки 2,0×1,5×2,5 см. Все вырезанные кусочки измельчают стерильными ножницами. Для посева составляют средние пробы по 15 г.

Определение общего количества микробов (кмафАнМ)

Общее количество микробов – это количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в 1 г (см³) продукта. Метод определения КМАФАнМ основан на способности мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при температуре 30 ± 1 °С в течение 72 ч. Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения. При исследовании свежей рыбы в питательную среду засевают разведения от 10^–1 до 10^–4.

Для посева 0,1 г продукта (разведение 10^–1) готовят первое десятикратное разведение взвеси: стерильной пипеткой набирают 1 см³ взвеси, переносят ее в пробирку с 9 см³ стерильного физиологического раствора (1 см³ полученного раствора содержит 0,1 г продукта).

Для посева 0,01 г продукта (разведение 10^–2) готовят второе десятикратное разведение: стерильной пипеткой перемешивают содержимое пробирки с первым разведением, набирают 1 см³ и переносят в пробирку с 9 см³ стерильного физиологического раствора (1 см³ полученного раствора содержит 0,01 г продукта).

Для посева 0,001 г продукта (разведение 10^–3) готовят третье десятикратное разведение: стерильной пипеткой перемешивают содержимое пробирки со вторым разведением, набирают 1 см³ и переносят в пробирку с 9 см³ стерильного физиологического раствора (1 см³ полученного раствора содержит 0,001 г продукта).

Для посева 0,0001 г продукта (разведение 10^–4) готовят четвертое десятикратное разведение: стерильной пипеткой перемешивают содержимое пробирки с третьим разведением, набирают 1 см³ и переносят в пробирку с 9 см³ стерильного физиологического раствора (1 см³ полученного раствора содержит 0,0001 г продукта).

В чашки Петри с заранее маркированной крышкой засевают по 1 см³ каждого разведения и заливают 10–15 см³ расплавленным и остуженным до 40–45 °С мясопептонным агаром (МПА). Сразу после заливки агара содержимое чашек Петри тщательно перемешивают путем легкого покачивания для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят на 72 ч в термостат при температуре 30 °С.

По окончании культивирования подсчитывают количество колоний, выросших на чашках с МПА. При этом используется лупа с увеличением в 4–10 раз или специальный прибор для подсчета колоний. При большом числе колоний и их равномерном распределении в агаре на дно чашки Петри наносят четыре или более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний в двух-трех секторах (но не менее чем на 1/3 поверхности чашки), находят среднее арифметическое число колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки.

Количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов в 1 см³ свежей рыбы (X) вычисляют по формуле

X = n × 10^m, (5)

где n – количество колоний, подсчитанных на чашке Петри;

m – число десятикратных разведений.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое подсчета двух чашек с разными разведениями продукта.