3. Методы детекции продуктов полимеразной цепной реакции.

Для визуализации результатов амплификации используются различные методы. Наиболее распространенным является электрофорез, основанный на разделении молекул ДНК по подвижности в электрическом поле, которая зависит от их размера.

1. Метод горизонтального гель-электрофореза.

Образцы вносятся в лунки, сформированные на поверхности пластины геля, приготовленного из 1,5-2,5% агара с добавлением флюоресцентного красителя ДНК - бромистого этидия, который включается в цепь и движется вместе с ней. Пластина помещается в электрофоретическую камеру, к которой подключен источник постоянного тока. Отрицательно заряженная ДНК движется от отрицательного полюса к положительному. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью и формируют полосу. По окончании электрофореза пластина перекладывается на аппарат, излучающий свет в ультрафиолетовом диапазоне. Энергия излучения поглощается красителем и заставляет его флюоресцировать оранжево-красным светом. По расположению окрашенных полос в исследуемом и контрольном образцах, при известной длине фрагмента, определяют наличие или отсутствие требуемого продукта ПЦР.

2. Метод вертикального гель-электрофореза.

Метод схож с предыдущим, но имеет ряд принципиальных отличий. Для проведения анализа используется специальная камера для вертикального электрофореза, в качестве разделяющей среды - специальный полимер (полиакриламид).

Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным и позволяет разделить фрагменты разного размера с точностью до одного нуклеотида. Недостатками метода являются высокая токсичность полиакриламида и сложность приготовления геля.

Для обычных исследований не требуется столь высокой точности разделения, поэтому чаще в диагностических лабораториях применяют метод горизонтального агарозного гель-электрофореза.

Лигазная цепная реакция (лцр).

Лигазы - группа ферментов, катализирующих соединение (лигирование) двух полинуклеотидных цепей за счет гидроксильной группы на 3'-конце одного олигонуклеотида и фосфатной группы на 5'-конце второго олигонуклеотида.

Для процесса сшивания (лигирования) необходимо, чтобы реакционные группы сблизились в пространстве. Эти условия создаются, если оба олигонуклеотида полностью комплементарны соседним участкам тестируемой ДНК. При этом, если хотя бы один нуклеотид, участвующий в лигировании, некомплементарен фрагменту, то сшивания цепей не происходит. Полученные фрагменты детектируются при помощи электрофореза.

Отличия ЛЦР от ПЦР.

1. На одной молекуле-матрице за 30 мин может быть синтезировано до 1 млрд. копий, то есть количественный выход ЛЦР значительно выше.

2. Специфичность ЛЦР в отношении однонуклеотидных замен выше, чем у ПЦР.

3. Высокая скорость протекания реакции имеет значение для проведения экспресс-диагностики, например, при определении степени облучения лиц, подвергшихся радиационному облучению.