Лекция 4.

Физическое картирование: как его можно модифицировать.

1) Использование редкощепящих рестриктаз: в лаборатории на факультете это NusI?1:10000 нукл.пар для генома человека. Распознает ГЦ- последовательность из 8 нуклеотидов. Редкая встречаемость. У бактерий 15-20 таких сайтов на геном. У эукариот еще реже: 15-20 на хромосому.

2) Каждая группа организмов характеризуется разным ГЦ-составом. Зная особенности используемого объекта, можно выбрать такую рестриктазу, чтобы сайты для нее встречались именно в данном геноме реже. Напр., Xba1, стандартная, режет по гексануклеотидной последовательности, которая очень редко встречается в геноме эукариот.

Нужно не только разделить геном на относительно крупные фрагменты, но и определить их размер. Для определения длины полученных кусков есть несколько подходов. В классическом понимании при картировании - гель-электропорация, и ее модификации. Позволяет разделять эти килобазные фрагменты.

Для генома млекопитающих характерна редкая встречаемость в геноме динуклеотида СG в связи с особенностями работы системы репарации. Цитозин часто метилирован, и при его дезаминировании получается тимин. Это довольно частое явление. В случае, когда цитозин не метилирован, из него при дезаминировании получается урацил. Его распознают и удалят. А тимин остается, т.к. это стандартное основание. Из-за метилирования у млекопитающих большая часть СG-пар со временем меняется на TG. А остаются СG-пары в только промоторных областях. Это СpG-острова, с аномально высоким содержанием СG-пар. Считается, что эти области выполняют регуляторную функцию, способствуя активации транскрипции. Sma1 – 1 сайт на 78 000 нуклеотидных пар по геному человека. В норме – 4 096 (4 в 6^ой степени) оснований. 200 млн нукл. пар в среднем на 1 хромосому в геноме человека.

Итак, получили фрагменты по 10 – 20 млн. нукл. пар. Более 10 000 в относительно низкоконцентрированных гелях. Разделяются фрагменты по 15-20 тыс.. Если уменьшить концентрацию агарозы до 0,3% (это минимум, после которого агароза уже не гель), то разделяется до 50 000 нукл. пар. То есть 50 000 – предельная разрешающая способность стандартного агарозного геля. Модификации электрофореза: изменение направления и интенсивности тока. Слайд: форез в ортогональном пульсирующем поле. Есть несколько модификаций пульс-электрофореза, они принципиально ничем не отличаются. Ток попеременно подается то на одну пару электродов (A на слайде), то на другую (B). При подаче тока в 1 направлении крупные фрагменты застревают в геле. Когда направление напряжения меняется, ДНК «выдергивается» из геля и продолжает движение в другом напавдлении. В результате при правильном подборе условий ДНК движется зигзагом, медленно, но верно. Раделение так более эффективное. Этим способом можно разделить фрагменты генома размером до 10 млн. нукл. пар., как куски плазмиды маленького размера – в стандартном геле. То есть, нужно правильно подобрать рестриктазы и использовать специализированные методики. Просто построить рестрикционную карту генома недостаточно. С помощью такой мотодики можно расположить на карте определенные локусы. Такие методы отрабатываются вначале в силу простоты исполнения на бактериальных геномах. Пример: бактериальный транспозон Tn5 (широко используется) содержит сайты рестрикции для Nus1. Стандартная ситуация: проводится направленный мутагенез фагом Tn5, отбираются мутанты по определенным генам с четко дефективным фенотипом. По фенотипу понятно, какой ген дефективен в каждом из мутантов. Кстати, дополнительно этим способом можно выяснить точную локализацию гена, в котором произошла мутация. Далее проводится рестрикция Nus1, и в участке, где появились дополнительные сайты рестрикции (то есть где встроился фаг), и произошла мутация. Так к рестрикционной карте можно привязать локусы некоторых генов. С небольшими модификациями тот же принцип используется и для картирования геномов эукариот.

В целом методика электрофореза трудоемкая и имеет свои ограничения. Одна из альтернатив электрофорезу – оптическое картирование. Есть несколько вариантов такого оптического карт-я. В целом принцип – это визуализация разрывов ДНК с использованием люминесцентных микроскопов. ДНК связывается с флюоресцентным интеркалирующим красителем и облучается ультрафиолетом и просто визуализируется под микроскопом. При этом надо иметь возможность видеть, где именно произошел разрыв. Поскольку в растворе ДНК представляет собой неупорядоченный клубок, для проведения оптического картирования нужно распрямить ДНК до линейной формы. Можно двумя способами:

1) агарозный гель при застывании меняет свою структуру. Если смешать ДНК с расплавленной агарозой, то при застывании агарозы ДНК будет менять конфигурацию в соответствии с образующимися порами геля. Клубок ДНК распрямляется, вытягивается и, более того, структура подвеграется определенному напряжению. При достаточно большом разрешении микроскопа в поле зрения будут попадать почти линейные участки ДНК. Как правило, стандартный стеклянный слайд содержит иммобилизованную рестриктазу, наверх капается раствор ДНК в рестрикционном буфере, в котором отсутствуют ионы магния. Все рестриктазы требуют дивалентных катионов, наилучший из них для рестрикции – магний. То есть, в отсутствии магния рестрикция не идет. Капля застывает, агароза полимеризуется, ДНК распрямляется, приобретает топологическое напряжение. Далее капли обрабатывают ионами магния и начинается рестрикция. При этом из-за напряжения в молекуле ДНК разрезанные концы немного разъезжаются. Затем идет обработка красителем и визуализация под микроскопом. Под микроскопом видно, в каких участках молекулы произошла рестрикция.

2) Другой подход к «распрямлению» хромосом – это молекулярное причесывание. В основе этого метода – 2 физических явления: способность ДНК сорбироваться на стекле и действие капиллярных сил. В раствор ДНК опускается покровное стекло, обработанное специальным способом, чтобы ДНК сорбировалась лучше. При этом ДНК какой-то своей частью закрепляется на покровном стекле, затем стекло начинает выниматься из раствора с помощью специалього очень медленного мотора. При прохождении стекла через поверхность раствора капиллярное натяжение поверхностной пленки воды распрямляет молекулы ДНК. То есть за счет капиллярных сил ДНК практически выравнивается. ДНК и в этом случае находится в напряженном состоянии. Далее процедура такая же: линейные напряженные препараты ДНК обрабатываются рестриктазой, и места разрыва визуализуются.

Суть методик фореза и оптического картирования одна: увидеть длину фрагментов, полученных при рестрикции. Причем оптическое картирование даже лучше: длина фрагментов измеряется непосредственно, а не опосредованно через подвижности.

Эти методики позволяют построить карты, но привязать к этим картам конкретные маркеры непросто.

Методика флюоресцентной гибридизации на препаратах (FISH) позволяет непосредственно локализовать на хромосомной карте интересующий Вас локус. Например, хочется выяснить, где на хромосоме расположен ген. Готовится радиоактивная или флуоресцентная проба к гену, ДНК фиксируется на стекле, а затем начинается гибридизация с препаратом ДНК. ДНК окрашивается специальным цитологическим красителем (например, по Гимза), чтобы получить характерную картинку полос. Далее ДНК рассматривается под флуоресцентным микроскопом. На препарате видно, где локализована метка. Значит, можно привязать флуоресцентный сигнал к карте полос на хромосоме. Для модельных объектов (основных организмов) давно построены цитологические карты. Есть характерный рисунок полос в результате обработки каждым из красителей. Цитологические карты – тоже своего рода физические карты хромосом, но тут расстояния не напрямую эквивалентны физическому расстоянию, потому что по-разному упакованы различные участки хромосом.

Проблема методики флюоресцентной гибридизации: низкая разрешающая способность, т.к. характерное цитологическое окрашивание возможно только для компактизированных хромосом. В хроматине есть ДНК и белки, и окрашиваются при взаимодействии с красителем именно белки. То есть используются метафазные хромосомы (компактизированные). Разрешающая способность методики FISH-картирования 1 млн.нукл.пар. Для реального расположения генов на геномной карте нужна большая точность. Большей разрешающей способности можно добиться при модификации этого метода. 1) механическое растягивание хромосом. Например, открутить в центрифуге,правильно выбрав ускорение. Белки при этом не отсоединяются, просто картинка становится чуть более размытой. Это увеличивает разрешающую спосбоность в 3-5 раз. Предел метода - 200 000- 300 000 нуклеотидных пар. Дальнейшая модификация связана с дальнейшим растягиванием хромосом, однако характерная цитологическая окраска утрачивается. Ненадежно. 2) Использование неметафазных (интерфазных) хромосом. Разреш. спос-ть – до 25 000 нукл.пар, но невозможно различить, с чем гибридизовалась метка. Нужно уже две метки, чтобы соотнести их расположение друг относительно друга. Это слишком трудоемко. Модификация методики - Fiber-FISH: фибер-рыба  Неметафазные хромосомы еще более растягиваются при помощи причесывания или растягивания в геле – только с хромосом удаляется белок – до 10 кб разрешающая способность.

Принципиально другой подход в физическом картировании – это STS-кртирование. Данная методика удобна тем, что одновременно строится физ. карта генома и отбираются клоны для последующего секвенирования. Работа ведется на геномной библиотеке. То есть картируются те самые клоны, на основе которых будет составлена геномная библиотека. Это тоже непрямое картирование. Физическое расстояние между локусами не измеряется. Оно подсчитывается сложными математическими формулами на основании частоты совместного размещения двух маркеров в одном фрагменте ДНК. Если случайным образом фрагментировать геномную ДНК и сделаем библиотеку с определенным размером вставки, например, 50 000 или 100 000 нукл. пар, есть определенная вероятность того, что 2 маркера будут попадать в один фрагмент. Если геном 1 000 000 нукл. пар, а вставки по 100 000, то вероятность нахождения одного маркера в определенном фрагменте равна 1/10. Вероятность того, что 2 маркера вместе будут именно в этом фрагменте, равна произведению вероятностей, то есть 1/100, или 1%.

Чем ближе локализованы маркеры, тем чаще они будут располагаться на одном фрагменте ДНК. Есть формулы, по которым цифры по частоте встречаемости маркеров на одном фрагменте переводятся в единицы, отражающие удаленность маркеров на ДНК. Для такого картирования нужна коллекция маркеров и коллекция фрагментов ДНК. Набор перекрывающихся фрагментов ДНК называется контиги. В простейшем случае это просто одна из геномных библиотек. Маркеры – это STS (Sequence Tagged Site), то есть сайт, который маркирован последовательностью. Это просто короткий фрагмент ДНК с известной нуклеотидной последовательностью. В простейшем случае это могут быть случайные фрагменты генома, которые были клонированы в какие-то векторы и потом секвенированы. Смысл имеет только тот маркер, который является уникальным в геноме. Если последовательность повторена, то в ее использовании как STS не будет никакого смысла. Требования к STS: должна встречаться в геноме 1 раз, нуклеотидный состав должен быть известен. Для STS 100 нукл. пар достаточно, лучше чуть больше. До 500 нуклеотидов. Самый удобный и основной источник – это IS 7 сиквенсы, то есть сиквенсы случайных клонов кДНК. Т.к. подавляющее количество матричных РНК соответствует уникальным генам, то очень вероятно, что случайный фрагмент кДНК удовлетворит требованиям к STS. Небольшая модификация этого подхода: использование в качестве STS полиморфизмов по коротким повторам. Эти полиморфизмы - минисателлиты и микросателлиты. Случайные геномные последовательности тоже можно использовать в качестве таких маркеров, но только в тех геномах, где низкая встречаемость повторов. Например, у бактерий. При использовании этого метода для эукариот нужно предварительно проверять уникальность маркера. Это существенно усложняет процесс.

Принцип STS-картирования СЛАЙД:

Есть хромосома и набор ее фрагментов, многократно перекрывающихся. Многократно перекрываются, чтобы можно было посчитать частоту. Для этото выделяются препараты ДНК из большого количества клонов, а потом ставится ПЦР с парами праймеров, которые подобраны к послед-тям от 100 до 500 нукл. пар. Если сиквенс есть, то можно подобрать пару праймеров, которая будет специфически его амплифицировать. Соответственно при помощи ПЦР можно легко детектировать наличие соответствующей STS-последовательности в геномном фрагменте. Если локусы расположены близко друг к другу, они часто будут попадать на один фрагмент ДНК. То есть чем ближе расположены локусы, тем больше вероятность их расположения на одном фрагменте. Зная среднюю длину фрагментов, можно статистически пересчитать растояние между маркерами и таким образом провести картирование и сразу отобрать клоны, которые будут перекрываться, для последующего секвенирования.

Есть 2 варианта реагентов картирования.

1. Для генома млекопитающих особенно актуален набор клеток радиационных гибридов. Это гибридомы клеток. Одна из слившихся клеточных линий, облучена летальными дозами ионизирующей радиации. Т.е. гамма-излучением, которое вносит двунитевые разрывы в хромосомы. Летальность связана с тем, что фрагментирован геном. Вторая линия не облучена, но дефектна по питательным потребностям. После слияния клеток и помещения их на селективную для необлученной линии среду выживать будут только клетки с комплементирующими участками ДНК из облученных клеток. Это когда клетка из облученной линии сливается с ауксотрофом, мутация которого находится в том же участке, который остался у первой интактным. Далее в клетке происходит целый ряд репарационных процессов. В том числе может происходить транслокация сразу нескольких фрагментов разорванных хромосом, они встроятся в геном необлученной клетки в случайных местах. При правильной постановке эксперимента достаточно получить около ста линий, чтобы был презентативный набор фрагментов. Они будут перекрывать весь геном, соответствующий геному необлученной клетки. Затем, когда у нас есть набор таких гибридом, радиационных гибридов, их можно использовать в качестве реагента картирования и делать все то же самое. С той разницей, что здесь чужеродные фрагменты будут встроены в хромосому другой бактерии. Но если использовать маркеры, которые отсутствовали в геноме необлученной клетки, то будет специфическая ПЦР, и, соответственно фрагменты можно достаточно быстро картировать. Удобство заключается в том, что кажлый клон, если выделять препарат ДНК, содержит достаточно большое количество этих фрагментов. Добавляются свои статистические сложности, но картировать можно, высчитывая вероятность совместного нахождения в одной линии гибридом двух маркеров. С небольшим количеством линий (100) нужно набирать больше статистики, то есть более точно вычислять вероятность совместного наследования. Методика детекции при использовании STS-маркеров была автоматизирована. Есть несколько подходов к модификации. Понятно, что детекция идет за счет ПЦР, которая ставится в планшетном формате, процесс роботизирован. На факультете – прибор для ПЦР в реальном времени, 1 планшета на 96 лунок, есть системы, которые рассчитаны на планшеты с 384 ячейками, а ячейка разбита еще на 4 части. Есть машины, которым можно зарядить сразу пачку этих планшет. 384*5 проб за 12 часов. Нужно после амплификации визуализировать результаты. Как всегда, для этого есть несколько методик  , например, ПЦР в реальном времени. Добавляется еще один зонд, специфический к середине ПЦР-продукта. Обычно если специфический продукт есть, сигнал детектируется. Если нет, то детекции не будет. Здесь немного другой принцип. Если во время ПЦР добавить интеркалирующий краситель, то сигнал будет детектироваться, если реакция идет. Но в этом случае ДНК будет непригодна для дальнейшего использования. Сейчас есть какие-то понтовые красители, которые окрашивают ДНК во время ПЦР и при этом не портят ее. Но это дорогостоящие реагенты. Но этот метод можно использовать только для каждого маркера в отдельности. Чтобы иметь возможность детектировать сразу два маркера в одной пробе, придумали следующее: конструируют зонд ДНК из примерно 20 нуклеотидов, к одному концу которого цепляют флуорофор. К другому – гаситель флуоресценции. На расстоянии в 20 нуклеотидов гаситель еще действует. У полимеразы есть 3прим-5прим экзонуклеазная активность. Когда идет ПЦР, то полимераза, двигаясь по ДНК, вырезает нуклеотиды, и они переходят в раствор. Если полимераза работает, то флуорофор и гаситель перейдут в раствор, причем на отдельных нуклеотидах. Т.е. есть реакция – есть флуоресценция. Причем чем больше продукта, тем сильней будет светиться. Вот это принцип ПЦР в реальном времени. Большинство машин позволяет детектировать сразу несколько таких меток, поскольку флуоресцентные белки есть разные, с разной длиной испускания. Тогда для каждого маркера – свой флуорофор, и можно гнать в одной пробе. Вывод: автоматизация процесса дает очень большой «КПД». Реальность этой методики была показана в 2002 году на проекте расшифровки мышиного генома. За пару месяцев одна лаборатория с хорошим оборудованием может дать бешеные результаты. За полгода было локализовано более 90 000 генов на карте хромосом гибридов. И еще несколько локусов тоже. Ошибок практически не было. СЛАЙД:Одну и ту же клонотеку при использовании STS-картирования либо в той, либо в другой вариации можно использовать и для физического картирования, и для последующего секвенирования, поскольку одновременно отбираются и фигачатся фрагменты генома.

Для эукариотических геномов, которые содержат, как правило, много хромосом, еще одна проблема при работе с ними – разделение хромосом. У большей части прокариот просто: одна хромосома. А у эукариот надо выяснить, на какой из хромосом находится фрагмент ДНК. Поэтому всегда стараются сделать отдельные библиотеки для каждой из хромосом. Стандартная методика разделения хромосом – это флюоресцентная их сортировка на приборе под названием FACS (fluorescent assistant cell sort). Это сортировщик клеток, которому помогает флюоресценция. Суть метода: те частицы, которые нужно отсортировать, метятся какой-то флюоресцентной меткой (она одна и та же что для клеток, что для хромосом), т.е. краситель связывается с ДНК. Готовится препарат определенной концентрации, затем препарат помещается в пробирку, из которой медленно капает раствор с препаратом. Одна частица – на одну каплю. Капли проходят мимо луча лазера, по другую строрну от которого - детектор флуоресценции (фотодетектор). Если частица имеется в капле, то будет какая-то флуоресценция, она улавливается, причем количественно. Чем крупней хромосома, тем сильней сигнал от частицы. Очень точное измерение: за время пролета капли машина определяет точно, какая хромосома в ней пролетела. Затем капля летит между двумя электродами. Один заряжает каплю в соответствии с уровнем ее флуоресценции. Еще два электрода создают линейное электрическое поле, в котором капли отклоняются в зависимости от заряда либо влево, либо вправо. И падают то в одну пробирку, то в другую. Таким образом препарат можно в соответствии с зарядом разделить на группы. На таком сортировщике можно разделить все хромосомы человека за исключением одной пары с более-менее одинаковой флюоресценцией. Затем там меняются красители, и эта пара тоже разделяется. После такого разделения можно строить банки хромосом для каждой из них в отдельности.