Лекция 9:

Знать: типы транспозонов, отличие Тн прокариот и эукариот, классы Тн, нормально классифицировать. Любые мобильные генетические элементы идентифицируются легко по нуклеотидной последовательности. Все без исключения Тн ограничены повторами по концам. В зависимости от типа транспозона структура этих хвостов отличается, но наиболее традиционная организация структуры представлена на СЛАЙДЕ:

По концам транспозона обязательно есть короткие или не очень короткие инвертированные повторы, зеркальное отражение друг друга. В точке, где Тн встроился в геном, всегда есть короткие прямые повторы, от 2 до 9 нуклеодидов, в некоторых случаях до 11. 2 – это только у эукариотических Тн, а именно у ретротранспозонов. Обычно от 4 до 9 нуклеодидов в прямых повторах. Инвертированные повторы внутри транспозона обычно имеют размер пары десятков нуклеотидных пар, от 15 до 30. В некоторых случаях могут быть очень длинными.

СЛАЙД: откуда берутся прямые повторы по концам транспозонов. Они связаны с работой фермента, который обеспечивает их перемещение. Это транспозаза. Она делает ступенчатый надрез в сайте-мишени, всегда для прокариот, но также и для перемещения эукариотических ретротранспозонов. Происходит дупликация концов за счет того, что стандартные системы репарации достраивают те одноцепочечные участки, которые остаются одноцепочечными после встраивания Тн. Остальные детали более специфичны для отдельных групп организмов. Прокариоты: мобильные генетические элементы делят на 2 класса: IS-элементы и собственно транспозоны. Принципиальных отличий в механизме премещения между ними нет. Это достаточно искусственное разделение. IS-элемент отличается тем, что транспозон обязательно несет какую-то функцию, не имеющую отношения к транспозиции. Т.е. транспозон – это IS-элемент плюс еще какой-то ген. IS-элемент – это «голый» мобильный элемент с повторами, необходимыми для перемещения, и с геном транспозазы. Транспозоны в свою очередь можно разделить на два класса: простые и составные. Простой транспозон обычно имеет короткие повторы на концах, ген транспозазы внутри и еще какой-нибудь ген во внутренней части транспозона. Повторы всегда короткие. У составных Тн повторы на концах очень длинные, от 1 000 до 1 500, 2 000 и даже неск. тыс нукл. пар. Каждый из этих повторов представляет собой стандартный IS-элемент. Короткие инвертированные повторы по концам, ген транспозазы внутри, все как у IS-элемента. Составной Тн так и называется потому что состоит из двух IS-элементов, а между ними – уникальная последовательность, например, ген антибиотикорезистентности. Большая часть составных транспозонов за редким исключением имеет один дефектный повтор. То есть как правило только один из повторов по краям кодирует функциональную транспозазу. Во втором повторе транспозаза инактивирована. Пример: бактериальный Tn5. Кодирует резистентность к каномицину. По концам – Is50, правый из них содержит только одну мутацию, которая инактивирует транспозазу и одновременно эта нуклеотидная замена создает промоторную последовательность, с которой считывается ген резистентности к каномицину. Эта нукл. замена делает хороший «-35»- сайт, обеспечивающий транскрипцию гена устойчивости к каномицину. Транспозаза использует инвертированные повторы по концам для перемещения мобильных элементов. Связывание транспозазы с ними необходимо для правильного надрезания донорной молекулы и последующего перемещения транспозона. В составном транспозоне работает одна транспозаза. Крайние части по концам инвертированных повторов – тоже повторы, такие же, как у IS-элементов. Транспозаза действует в цис-положении на любую пару инвертированных концевых повторов, которые есть на одной молекуле ДНК. Просто эффективность распознавания повторов патдает с увеличением расстояния между ними, и чем дальше они от гена транспозазы, тем также хуже распознаются. Наиболее эффективно перемещается просто IS-последовательность. Ее перемещение сложней детектировать, т.к. нет маркера антибиотикорезистентности. Потому на них не обращают внимания. Сам функциональный повтор скачет гораздо лучше, чем целые Tn. Транспозаза одного мобильного элемента может обеспечить перемещение всех других элементов. При этом дефектный элемент будет перемещаться лучше, чем полностью транспозон. Когда транспозон встроен в фазмиду, получается следующее: СЛАЙД если в pUC18 размером 2,7 кВ встроить Tn10, который имеет размер 10 кB нукл пар., то плазмидная часть в составе этой фазмиды намного меньше, чем транспозоновая. Из такой структуры эффективность транспозиции самого транспозона, т.е. прямая транспозиция, будет ниже, чем так называемая инвертированная транспозиция. из кольцевой молекулы выщепляется участок плазмиды с повторами по краям. Фактически это уже новый транспозон, несущий плазмидный маркер антибиотикорезистентности. Так действительно возникают новые транспозоны. IS-элементы – основная движущая сила всех мобильных генетических элементов. Характеристики IS-элементов: СЛАЙД. Показаны названия, повтор мишени, инвертированные повторы и их размеры. В мишени дупликации от 4 до 9 нуклеотидных пар. Чуть реже – 11-13. От 9 до 41 нуклеотидных пар непосредственно распознается ферментом. Самый короткий - IS1. Он достаточно эффективно перемещается. Существенный фактор – различие в специфичности перемещения. Всегда фермент связывается с какой-то определенной последовательностью нуклеотидов, просто она может быть длинней или короче. Чем она короче, тем более случайным будет процесс распознавания. Транспозазы сильно варьируют по своей специфичности. Считается, что для Is1 характерна случайная транспозиция. Tn9 фланкирован двумя Is1, между ними – ген хлорамфеникол-резистентности. Для мутагенеза капризен. Скачет хорошо и часто, но всегда в одно и то же место. А Is50, для которого прописаны в таблице горячие точки, достаточно случайно работает. Информация о «горячих точках», т.е. сайтах наиболее частого встраивания, берется из опытов на плазмидах. Например, для pBR322 четверть всех инсерций будет в одну-единственную точку этой плазмиды. А 75% всех инсерций будут случайно разбросаны по плазмиде. Так же и в бактериальном геноме и хромосомах. Есть мобильноые элементы, которые встраиваются очень выборочно, в конкретные последовательности. Tn7 – пример транспозона, который кодирует резистентность к триметаприму и встраивается в геном ешерихии коли в один-единственный сайт. Эта последовательность известна, длинная, похожа на attв-сайт для фага лямбда. Даже механизм перемещения немного отличается от такового других транспозонов. Т.е. от абсолютно рандомного встраивания до строгой специфичности. Механизм транспозиции: есть 2 приципиально различных по результату механизма транспозиции, консервативный и репликативный. При консервативной транспозиции транспозон вырезается из донорной молекулы и встраивается в реципиентную, оставляя двунитевой разрыв в молекуле ДНК. При репликативном механизме он не вырезается, а в реципиентной молекуле создается его копия без утраты его в исходном месте. Между этими двумя механизмами очень много общего. Репликативная транспозиция первой была изучена. Консервативная транспозиция – небольшая модификация этого процесса. Любая транспозиция всегда начинается с однонитевых разрывов донорной и реципиентной молекул.

СЛАЙД. Транспозаза связывается с инвертированными концами транспозона и димеризуется. То есть для инициации транспозиции должна сформироваться промежуточная структура в виде петли. Транспозаза режет одну нить по концу повтора и этот же активный сайт распознает сайт-мишень на другой части этой же цепи ДНК. Поскольку активные центры подвинуты друг относительно друга, в результате образуется ступенчатый разрыв. Слайд – результат. Затем концы стыкуются. Формируется промежуточная структура. Лучше всего репликативная транспозиция описана в книге Спирина. После стыковки однонитевых разрывов формируется структура, похожая на репликативную вилку. С каждой стороны – свободный 3прим-ОН конец, с которого начинается полимеризация. Когда цепи разделяются, получается структура коинтеграта, объединнной донорной и реципиентной молекулы. При достройке концов донорной и реципиентной молекул они бы слились. Следующий шаг – разделение двух молекул. После этого в каждой из молекул остается копия такого транспозона. За разделение коинтеграта отечает сам транспозон. По механизму сайтспецифической рекомбинации. Фермент – резолваза. Кодируется самим Тн. Однако если инактивировать резолвазу, разделение все равно будет происходить за счет гомологичной рекомбинации. Но резолвазная система обеспечивает гарантированное разделение рекомбинацией, то есть разделение будет обязательно на 2 автономные молекулы. Гомологичная рекомбинация расцепит только половину молекул. Она работает в обе стороны: на разделение и на слияние, они будут в динамическом равновесии. Резолваза же только разделяет. Еще один СЛАЙД: фаг мю. 38 кВ. Один большой транспозон. В его состав помимо двух генов (два разных мономера транспозазы, из них получается в итоге гетеротетрамер) входят гены, нужные для упаковки этого фага, репликации его ДНК. Механизм репликации – собственно транспозиция. Перед упаковкой фаг очень активно скачет по геному и затем пакующие ферменты вырезают его копии из генома вместе с небольшим куском геномной ДНК. Упаковывается сам фаг и около ста нуклеотидных пар с одного его конца и с другого. Эти отрезки всегда произвольные. Существует в клетке в виде профага. Способен перемещаться и по коинтегративному механизму, и по репликативному. При первичной

интеграции в хромосому фаг использует консервативный механизм, а потом при паковке репликативный. То есть пока нет достаточного количества копий фага, убиваь клетку нет смысла. А она погибнет при консервативной транспозиции. СЛАЙД. интермедиат из двух кольцевых молекул. Два способа разделения такой структуры. Если внести двунитевой разрез, то это консервативная транспозиция. Если не вносить, то получаем коинтеграт, это уже будет репликативный механизм. Фаг мю контролирует активность своей транспозазы: в норме этот белок обеспечивает репликативную транспозицию, а при первичной инфекции за счет модификации активности фермента идут дополнительные разрезы, которые полностью вырезают его из донорной молекулы и встраивабт в молекулу-реципиент. Это имеет смысл, так как донорная молекула в данном случае линейная молекула ДНК. Если бы и здесь был репликативный механизм, то коинтеграт был бы линейным. Бактерия бы погибла за счет того, что линейный геном не смог бы реплицироваться. Даже при консервативной транспозиции можно выделить пожожую промежуточную структуру. Конкретные детали при перемщении Тн по консервативному механизму могут существенно различаться. СЛАЙД: варианты транспозиции. Ковалентное замыкание концов (плазмидообразная форма) для транспозонов тоже возможна. Наиболее хорошо изученные транспозоны - семейство TnA = Tn1, Tn3, на самом деле это один и тот же транспозон просто исторически был назван немного по-разному. Есть между ними небольшие различия, но они сформировались в лабораторных условиях. Просто организованы, все кодируют резистентность к ампициллину, бета-лактамазу одного класса, несут ген транспозазы, резолвазы и сайт для действия последней. Он же – res-сайт. В нем происходит разрешение коинтеграта. Тот же сайт фактически и контролирует активность транспозазы. Резолваза выступает еще и в качестве транскрипционного регулятора. Операторная часть одного гена увеличена, к нему присоединяется резолваза. Она блокирует транскрипцию транспозазы, а связывание с другим сайтом стимулирует активность резолвазы. Когда транспозон появляется, то транспозаза активничает, затем начинает синтезироваться резолваза. Она выключает транспозазу и стимулирует синтез самой себя. В итоге сначала консервативная транспозиция, затем стимулируется разделение коинтеграта. Для перемещения транспозона не нужно ничего, кроме инвертированных повторов по концам. Именно их (отрезки в пару десятков нуклеотидов) распознает транспозаза. Ген транспозазы даже не должен располагаться между этими транспозонами. Способность транспозонов к инвертированной транспозиции широко применяется для транспозонового мутагенеза. СЛАЙД: мини-производное от Тн5, плазмида-самоубийца. При введении в клетки мутагенизированного штамма реплицироваться не может. Плазмида кодирует ген транспозазы. Рядом с этим геном транспозазы встраивается одно из мини-проиводных транспозона. Есть разные варианты таких производных. СЛАЙД: гены устойчивости к антибиотикам. От Тн осталось 19 нуклеотидных пар с одной стороны и с другой. Такая конструкция помещается рядом с геном транспозазы и когда вектор вводится в реципиентную клетку, мини-транспозон перемещается из этой молекулы в хромосому. Плазмида утрачивается, реплицироваться она не может. В реципиенте (в его хромосоме) остается только одна копия транспозона. Более сложные производные - на СЛАЙДе. Помимо резистентности к антибиотикам добавлены репортерные гены. Обычно это гены ферментов без промотора и в некоторых случаях без рибосомсвязывающего сайта. Инсерция такого транспозона внутрь какого-то гена при условии, что он встроен в правильной ориентации, помещает репортерный ген под промотор гена, в который он встроен. Это удобно использовать в лабораторной практике. Этот ген как правило кодирует фермент, дающий цепную реакцию. Позволяет судить об активности мутантного гена в разных условиях. Т.е. по измерению активности фермента или просто по визуальному наблюдению, можно определить активность гена и измерить ее либо ферментативно, либо люминометрически. Транспозоны сейчас используют реже, но их значение не уменьшается. Цифры, получаемые в результате таких репортерных исследований, более точные. Если сравнивать их с транскрипционными исследованиями, в классическом варианте - микрочипы, то все же транскрипционные методы требуют уточнения, они не очень точные.

Транспозоны эукариот. Первые транспозоны были открыты именно у эукариот. В 40^х годах были опубликованы статьи Барбары МакКлинток по исследованиям мутаций кукурузы. Получила за это заслуженную Нобелевскую премию через 40 лет после выхода статей. Она объяснила существование транспозонов, не зная их генетической структуры, используя только генетические методы. Четкие, красивые эксперименты. Классические транспозоны Мак Клинток интересны тем, что похожи на бактериальные транспозоны, которые перемещаются по консервативному механизму. Тн вырезается их того места, где он был и встраивается в новое место. Также они похожи на бактериальные консервативные Тн тем, что достаточно легко можно сделать мини-производное этих транспозонов. Делеция гена транспозазы инактивирует конкретный транспозон, но если в в цис-положении присутствует ген транспозазы, он будет распознавать инвертированные концы и будет обеспечивать перемещение транспозона. Структура этих транспозонов: СЛАЙД. Классический AS-элемент, активатор по Мак Клинток. Содержит классические повторы по концам. Внутри - одна существенная для перемещения рамка считывания, один ген, который разбит на 5 экзонов, разделенных интронами. Чтобы интрон перемещался, это все должно транскрибироваться, процессироваться, транслироваться, и результат – транспозаза, которая по структуре соответствует бактериальной транспозазе. Механизм перемещения точно такой же. Мак Клинток работала с транспозонами двух типов: она выделяла активатор и диссоциатор. Оказалось, что диссоциатор – дефектная копия активатора. Сейчас изучены уже различные линии диссоциаторов. Это делеции различной протяженности внутренней части активатора. То есть это семейство транспозонов, в котором есть один активный, кодирующий транспозазу, и его различные делеционные производные, которые активной транспозазы уже не имеют. Таких семейств в геномах растений достаточно много, наиболее известные показаны на СЛАЙДе. Активатор и диссоциатор: SPM – супрессор-мутатор и DsPM (нет конкретной расшифровки, дефектный s-pm. Они же - энхансер и ингибитор. Есть еще мутатор и производное от этого мутатора. У кукурузы транспозоны лучше изучены. Для всех эукариот совершенно общая тенденция: классический ДНК-транспозон у эукариот очень быстро накапливает различные делеционные производные. Если в геноме есть активный транспозон, то он будет обеспечивать перемещение себя самого и разных производных, которые сами транспозазу не кодируют. Чем ближе концы инвертированных транспозонов, тем больше он перемещается. Парадокс: делеционные производные транспозона могут перемещаться лучше, чем активный транспозон. Даже если дефектные мутанты перемещаются с меньшей частотой, все равно с течением времени их количество накапливается. Т.е. если такой транспозон прыгнул, то появляется его копия в геноме. И транспозаза должна «отвлекаться» и на нее. Конечный результат: чем больше накапливается делеционных производных, тем менее эффективным оказывается перемещение всего семейства транспозонов. Транспозаза должна связываться с каждой из этих копий. И ее не хватает. В конце концов делеционных копий оказывается слишком много, случайным образом происходит инактивация последнего активного транспозона, и все семейство вымирает. Они по-прежнему есть в геноме, их легко можно детектировать, т.к. их структура стандартна, но они больше не перемещаются. В геноме человека достаточно много семейств вот таких ДНК-транспозонов, и они все без исключения неактивны. Это уже реликты мобильных генетических элементов такого класса. Есть СЛАЙД, который показывает различие в эффективности транспозиции таких транспозонов и ретротранспозонов эукариот. СЛАЙД: про супрессор и мутатор. Модификации такой классической схемы: это семейство элементов: SPM-элементы и энхансеры – почти одно и то же. Они имеют одинаковую структуру. Помимо гена транспозазы (11 экзонов) у этих Тн есть еще две открытых рамки считывания. Эти гены имеют отношение к перемещению этих элементов. Обе рамки располагаются внутри длинного интрона. Это гены хелперных белков, которые способствуют активации транспозазы. Вроде бы одна из этих рамок не критична для перемещения. Но как мимимум одна из них необходима. Если ее инактивировать, то получается дефектное производное этого транспозона, которое перемещается, но со значительно меньшей эффективностью. Полностью инактивирующая мутация должна охватить один из экзонов гена транспозазы. Другие ДНК-транспозоны эукариот: еще у растений – LINE-транспозоны (миниатюрные), непростая схема перемещения. У животных: есть ДНК-транспозоны. Классические из них – это P-элемент дрозофилы. P-элементы появились у Drosophila melanogaster в 40^е годы 19 века. До этого все формы, которые выделялись из природы, не имели P-элементов. А в 50^х P-элементы находились почти у всех диких форм. P-элементы очень быстро распространились в природных популяциях. Их распространение между популяциями обеспечивают наездники. Паразиты захватывают часть цитоплазмы и впрыскивают уже в следующую жертву. В результате происходит распространение транспозона.

Это простой транспозон, по концам которого есть инвертированные концевые повторы. Тип такой же, как у кукурузы. Есть и по-другому устроенные транспозоны. Например, у элементов B имеются длинные инвертированные повторы. По структуре он соответствует составному прокариотическому транспозону. В геноме дрозофилы значительная часть мобильных элементов имеет совсем другую структуру: прямые повторы на концах. Это нетипично для классических составных транспозонов. Это уже ретротранспозоны. P-элементы дрозофилы: наиболее изученные у дрозофилы. Были обнаружены на классических генетических экспериментах при исследовании явления так называемого гибридного дисгенеза. Суть явления: в зависимости от того, какой из родителей несет P-элемент, получается различный эффект на потомство. Если P-элемент у самца, то гибриды стерильны, когда у самки - фертильный. Стерильность гибрида связана с очень активным перемещением транспозона у потомков скрещивания во время развития генеративных клеток. При реципрокном скрещивании такого перемещения транспозона не происходит. Мобильный генетический элемент кодирует, помимо транспозазы, еще и репрессор транспозиции. СЛАЙД: структура элемента. Этот элемент дает достаточно длинный транскрипт с одного промотора, который способен дать начало двум разным белкам. Рамка считывания одна, несколько – экзонов (недочет слайда). В результате альтернативной процессии может образоваться либо полноразмерный белок, и это будет транспозаза, либо укороченный белок. Он будет репрессировать транспозицию. По какому пути пойдет процессинг – зависит от того, в каких клетках происходят эти процессы. В соматических клетках репрессор достаточно эффективно процессируется, в генеративных клетках репрессор практически не синтезируется. В генеративных клетках синтезируется в основном транспозаза, а репрессора нет. Ситуация, когда одна и та же цепь ДНК кодирует 2 белка: и репрессор, и транспозазу, - достаточно стандартная. У бактерий такая ситуация есть, многие транспозонгы кодируют свои транспозазы и репрессор, и почти всегда репрессор – просто дефектный вариант транспозазы. Он связывается с теми же самыми концами транспозона, но не может осуществить транспозицию. Происходит экранирование сайтов связывания функциональной транспозазы. Механизм дисгенеза: сперматозоид практически не несет цитоплазмы, а яйцеклетка богата цитоплазмой, именно в цитоплазме рецептор и располагается. СЛАЙД. Если материнская клетка содержит ген, который кодирует P-элемент, в этой клетке будет присутствовать достаточно большое количество репрессора. Репрессор сохраняется у всего следующего поколения. Эта молекула (репрессор) очень стабильна и присутствует во всех клетках дочернего организма. Соответственно репрессор будет и в генеративных клетках, хотя там он и не синтезируется. То есть он будет присутствовать, потому что он есть еще у матери. Его количество оказывается достаточным, чтобы блокировать перемещение транспозона. Если Р-элемент находится в мужском организме, то потомок не получает ни одной молекулы репрессора, и затем в генеративных клетках с началом экспрессии Р-элемента ничто не препятствует его перемещению. Он активно скачет, и в результате зародыш получается дефектным из-за перемещений Р-элемента. Копий Р-элемента немного, а репрессор синтезируется достаточно эфективно. Достаточно одной молекулы репрессора, чтобы она связалась с каждой их этих копий. Таким образом, видно, что у эукариот есть транспозоны, похожие на бактериальные. Свои нюансы накладываются тем, что гены прерывистые, экспрессия идет немного по-другому. Есть дополнительные возможности для регуляции. Эукариоты имеют еще и другой класс мобильных элементов, ретротранспозоны. Их также 2 типа, принципиально различающихся. Общее между ними то, что они перемещаются с использованием РНК в качестве промежуточного продукта транспозиции. Сначала транскрипция, затем обязательно обратная транскрипция, вследствие этого мобильный элемент должен кодировать обратную транскриптазу. Это общее между классами. Самый простой для понимания механизм перемещения ретротранспозонов касается класса тех ретротранспозонов, которые сродни ретровирусам. Что из чего произошло – непонятно. Либо ретротранспозон упрощенная версия ретровируса, либо ретровирус – усложненная форма ретротранспозона. Скорей первое. Есть ретровирусы с геномом, представленным ДНК. Им для встраивания тоже нужна РНК-стадия. Чаще всего их геном пакуется в клетке в белки капсида, и эта вирусная частица обеспечивает инфекцию следующей клетки. Транспозон отличается от ретровируса тем, что нет внеклеточной стадии. Транспозон не пакуется, способен перемещаться только внутри определенной клетки и для переноса его в другую клетку должны быть особые условия. СЛАЙД геном ретровирусов. Основной признак, по которому выделяют этот класс ретротранспозонов, - наличие прямых повторов по концам Тн. Эти повторы полностью идентичны. Внутренняя часть ретровирусов представлена тремя генами. Это «условные» гены, так как транскрибируется вся матричная РНК вместе. Затем идет трансляция, причем как правило этот процесс эффективен для первого гена, а для транскрипции последующих генов нужен сдвиг рамки считывания или супрессия стоп-кодона = трансляционная супрессия. Как правило, происходит первое. Эти гены транслируются с эффективностью порядка 5% от трансляции первого белка. Именно первый ген кодирует обратную транскриптазу. Env-ген кодирует белки оболочки. Gag-ген что-то еще кодирует. Эти гены – тоже достаточно условная штука, продукт трансляции подвергается протеолизу. Одиночные белки капсида – результат расщепления первичного транслята на отдельные участки. Перемещение таких ретровирусов: СЛАЙД как организованы разные производные ретровирусов. На слайде – стандартный ретровирус. Большая часть ретротранспозонов – это всего лишь делеционные варианты ретровирусов. Классический пример – Ty-элемент (transposon yeast) дрожжей. Несет на концах длинные повторы, то есть Long Terminal Repeats (LTR). По историческим причинам они называются дельта-элемент дрожжевых транспозонов. Внутри две рамки: TyA – это gag-ген, TyВ – это pol-ген. Env-ген отсутствует. Интегразы, видимо, тоже нет. Четко выделяется две рамки считывания. Одна соответствует gag-гену, другая - pol-гену. Еще один элемент дрозофилы, copia, тоже содержит вроде бы одну рамку считывания, но она несет гомологию с этими двумя генами. С pol-геном – в любом случае. Ну а больше ничего и не нужно, поскольку именно она кодирует обратную транскриптазу. Еще один класс транспозонов отличается: уже нет прямых повторов, но есть обратная транскриптаза. СЛАЙД. Механизм ретротранспозиции: обратная транскриптаза на своем собственном транскрипте обеспечивает сначала синтез небольшого фрагмента, близкого к начальному повтору, используя транспортную РНК в качестве затравки. РНК отжигается рядом с левым инвертированным повтором. Идет сначала обратная транскрипция этого повтора. Так как обратная транскриптаза обладает и РНК-азной активностью, так называемая РНК-аза Н (эйч). Она же обеспечивает небольшое подъедание вот этого конца, части этого повтора. Получаем кДНК, выступающую с той стороны. Это позволяет осуществить процедуру смены матриц. Подъедание некритично. Транскрипт может отсоединиться и гибридизоваться с левым концом, потому что это повторы, и они комплементарны. Диссоциация идет не очень эффективно. Поэтому активность РНК-азы Н критична в данном случае. Образуется двунитевой участок, спаривается с другим концом и выступает в качестве затравки для дальнейшего синтеза ДНК. После смены матриц мы получаем целиком полный транскрипт. СЛАЙД. Синтез следующей цепи начинается с РНКазной активности: расщепляет первичный транскрипт. Расщепление идет неполное, остаются какие-то фрагменты от матричной РНК, они используются в качестве затравки для второй цепи ДНК. Потом синтезируется до конца часть этой второй цепочки, потому что начало ее может быть несинтезировано. Ведь праймеры были случайные фрагменты – итог действия РНКазы Н. Чтобы произошла репликация начала, опять должна произойти смена матриц. Недосинтезированная матрица должна присоединиться к другой матрице, досинтезированной, хоть к той же самой цепи. Тогда она досинтезируется до конца. Но затравка остается. С этой затравки «-»цепь дореплицируется до конца. В результате имеем полностью завершенную двухцепочечную структуру ретровируса с полными копиями концевых повторов. Это весь ретровирусный транспозон. Потом эта структура должна встроиться в геномную ДНК, а механизм перемещения сходен с консервативной транспозицией. Продукт гена интеграза обеспечивает ту же функцию, что и транспозаза прокариот. По структуре интегразная часть входит в состав другого белка как домен. Как и транспозаза, она образует ступенчатые концы, они встраиваются в сайты-мишени, затем идет дупликация концов в сайте-мишени. Так встраивается ретровирус. Но такого типа ретровирусы могут захватывать какие-то клеточные гены в состав своей ДНК. СЛАЙД: показывает,что Ty-элемент имеет структуру такого же типа, даже способен образовывать псевдовирусные частицы. Еще один тип ретровирусов: с полиА-элементами. Они же - элементы без длинных концевых повторов, или LINE-элементы (long interspersed nuclear elеment). Это название исторически сложилось:были обнаружены как сателлитная ДНК, то есть большое количество копий в геноме. И потом выяснилось, что это транспозоны. В состав этого транспозона входит обязательно ген обратной транскриптазы, она имеет и РНКзную активность. Обязательна еще эндонуклеазная функция. Выполняет ее отдельный домен транскриптазы. То есть для перемещения этого элемента достаточно одной рамки считывания. В LINE-элементах всегда есть вторая рамка считывания. Непосредсственно для перемещения она не нужна. Еще нужен полиА-хвост, без него не переместится. Механизм транспозиции: полиА хвост гибридизуется скакой-то последовательностью в геноме мишени несколько Т подряд. Эндонуклеаза распознает эту структуру и обеспечивает однонитевой разрез, разрыв в одной цепочке Получается затравочный конец, 3прим-ОН. Синтезируется кДНК. Все это осуществляется одним белком. Потом идет синтез 2^ой цепи и интеграция в хромосому. Детали этого процесса не совсем понятны. Должен быть сделан второй надрез и встраивание досинтезированной цепи. По одной модели: надрез делается в самом начале, а фермент держит концы вместе. Потом все интегрирует. Другая модель: делается надрез, идет синтез матрицы, потом второй надрез, фермент при перемещении держит концы РНК и ДНК вместе. По окончании синтеза – процессы репарации: застройка брешей и замена РНК на ДНК. Структура стабилизируется после лигирования. Репарация может происходить и после лигирования. Ретротранспозоны гораздо более эффективны в плане транспозиции, чем ДНК-транспозоны.

ТРАНСПОЗОНЫ (ПРОДОЛЖЕНИЕ).

Обратная транскриптаза очень часто отваливается раньше времени, и у таких делеционных производные конец будет реплицироваться, а начало ретровирусного генома не будет реплицировано. Такие транспозоны потом уже не перемещаются, потому что у них нету промотора своего собственного, они не транскрибируются, и соответственно нет мРНК, она не мигрирует в цитоплазму, и вообще они не являются субстратом для транспозиции. А если бы даже и являлись, если каким-то образом дефектный транспозон попадает под активный промотор, он всё равно не кодирует функциональной обратной транскриптазы, т. е. этого белка нету, он не свяжется с дефектной копией, и не будет идти транспозиция. С небольшой вероятностью обратная транскриптаза может связаться не со своей матрицей, но это не очень эффективный процесс. В случае ДНК-транспозонов (слайд показывает ситуацию) понятно что для перемещения должна идти транскрипция, транскрибируется ген транспозазы, мРНК попадает в цитоплазму, идёт трансляция, транспозаза синтезируется, но мишень для транспозазы она в ядре находится т. е. транспозаза независимо от своей мишени попадает в ядро где естественно может связаться уже с любыми инвертированными повторами, не только с инвертированными повторами интактного транспозона, но и с дефектными. И чем ближе эти повторы друг к другу, чем больше делеции тем более эффективным будет перемещение. Слайд показывает принципиальную разницу. Именно по этой причине ретротранспозоны эукариотических геномов более эффективны, как LINE-элементы, так и ретровирусоподобные. Эта ситуация особенно характерна для LINE-элементов.

Слайд показывает один интересный факт. За значительную часть псевдогенов в эукариотических геномах (за их появление) отвечают ретротранспозоны (это и LINE-элементы и ретровирусы тоже могут этим заниматься, но в принципе любой МГЭ, который кодирует обратную транскриптазу, может обеспечивать формирование псевдогенов). С LINE-элементами получается проще, потому что в принципе в зависимости от того, куда встроился этот LINE-элемент при его транскрипции может захватываться соседний ген, особенно когда это дефектный LINE-элемент. Есть ещё такое явление как LINE-трансдукция, т. е. при обратной транскрипции с очень небольшой эффективностью захватывается соседний участок генома. Естественно, что потом полученный транскрипт процессируется, из него вырезаются интроны и в новое место встраивается кДНК копия (не содержит интронов). Как правило, не содержит одного из конца генов также, т.е. трансдуцированный ген получается дефектным. Таким образом, получается достаточно много псевдогенов. Этот механизм генерирования псевдогенов в некоторых геномах оказывается достаточно эффективным. В частности, если говорить о хлебных дрожжах, Sacharomyces cerevisiae – у них достаточно нетипичный для эукариот геном. Нетипичность заключается в том, что в кодирующей последовательности генов практически нет интронов, только 5 генов хлебных дрожжей имеют интроны, причём все они располагаются в некодирующей части, в самом начале гена. Считается, что в какой-то момент такой механизм генерирования псевдогенов привёл к удалению интронов из генома дрожжей. По каким-то причинам в этом довольно компактном геноме эволюционно выгодно иметь прцессированные псевдогены, но он естественно может экспрессироваться, если подстраивается под промотор. В геноме хлебных дрожжей эти процессы шли достаточно эффективно и привели к практически полному удалению интронов. Для сравнения – пивные дрожжи – у них всё нормально, интроны разбросаны по всем генам.

Ещё один класс мобильных генетических элементов, наиболее эффективный у нас с вами в геноме представлен SINE-элементами. Аббревиатура похожа на LINE, только здсь S - shot. Сходство по названию имеет еще функцмональное значение, оно также подчёркивает тот факт, что SINE-элементы используют механизм транспозиции LINE-элементов. Это не значит, что SINE-элемент - это делеционное производное LINE-элемента, как правило, различные SINE-элементы происходят от коротких ядерных РНК, транскрибируемых РНК-полимеразой-III (третьей, потому что у нее промотор внутри гена). Соответственно, это какие-то модифицированные, мутантные версии этих генов. Они каким-то образом распознаются обратной транскриптазой INE-элементов. Это, наверное, немножко противоречит слайдам в соответствии с которыми SINE-элемент должен распознаваться только своей собственной матрицей но с определенной вероятностью идёт распознавание и чужой матрицы, в частности, вот таких модифицированных версий малых ядерных РНК. И естественно, такое распознавание приводит к перемещению этих малых ядерных РНК. Такие SINE-элементы в геномах различных организмов будут иметь различное происхождение. В частности у нас с вами наиболее эффективный SINE-элемент, которого1,5 млн копий в геноме называется Alu (это название рестриктазы Alu-1, которой резалась одна фракция сателлитной ДНК). Оказалось что есть сайт для этой рестриктазы в SINE-элементе, поэтому если сателлитную ДНК резать этой рестриктазой, то получаются фиксированного размера фрагменты в огромном количестве, которые из разных частей генома происходят.

Структура Alu- последовательности: левые и правые части имеют гомологию с тем siРНК ядерной. Эта РНК есть в любом ядре, однако у других организмов SINE-элементы как правило от других малых ядерных РНК происходят. Фактически эит части, каждая из них это повтор этой РНК. Между ними располагаются полиА последовательности, но в принцие, это, наверное, тандемная дупликация одной и той же РНК, только вот эта часть значительно укорочена и не функционирует при транспозиции, функциональной оказывается вот эта. Размер Alu-элемента в среднем около 290 н.п. Различные копии немножко варьируют по своему составу. Каким образом стандартная малая ядерная РНК стала распознаваться ферментами, которые LINE-элемент кодирует не совсем понятно, но чётко экспериментально показано, что LINE-элемент, один-единственный, который в геноме человека активен, L1 он необходим для перемещения Alu-элемента, если его выключить, то и Alu не скачут (это всё на клеточных линиях показано). Геном человека немного необычен, т.к. у нас всего один-единственный SINE-элемент есть, но зато он очень сильно распрыгался по геному. У мышей их 4, приблизительно равномерно представленных и их суммарное количество - примерно как и в геноме человека. ДНК - транспозоны очень неэффективны, в геноме человека они вымерли давным-давно. Всего около 3% генома занимают ДНК-транспозоны. Ни один из них не является активным, это реликты. В большей части транспозонов уже трудно найти какие-то сайты транспозазы, но тем не менее определенное сходство нуклеотидных последовательностей с известными транспозонами есть, поэтому эти 3% фиксируются как бывшие транспозоны. Ретровирусоподобных ретротранспозонов сейчас ни одного активного в геноме человека нет, но относительно недавно в нашем геноме эти звери прыгали и напрыгали на 8% и присутствуют в числе копий около 450 000. LINE-элементы, наиболее эффективные представители мобильных генетических элементов у нас с вами в геноме, и один из них чётко показан функционально. Может ещё какие-то есть. Показать перемещения мобильных генетических элементов в человеческом геноме сложно, т.к. работа идёт на клеточных линиях. Чисто экспериментально процедура достаточно сложная и во многом содержит элемент везения. SINE-элемент - это у нас фактически только Alu-последовательность. Более 30% генома занимает класс транспозонов, которые используют механизм перемещения, основанный на действии эндонуклеазы и обратной транскриптазы. Все цифры очень приблизительны, т.к. это уже неактивные МГЭ и какую-то их часть, которая уже сильно видоизменена, мы уже не зафиксируем. В связи с тем, что такой огромный процент генома занимают МГЭ, может возникнуть вопрос: а что они там делают? Никто это вам точно не скажет. Как-то так получилось, что геном эукариот очень толерантен к увеличению размера и на эволюционном уровне это, скорее всего, компенсируется теми преимуществами, которые большое количество областей гомологии в геноме создают для рекомбинационной эволюции. Слайд иллюстрирует возможные перестройки в геноме, которые могут быть обусловлены рекомбинациями между идентичными копиями транспозонов, разбросанных по всему геному. Поскольку все эти мобильные генетические элементы, особенно в тот момент, когда они впервые инфицируют геном, очень интенсивно перемещаются по всему геному, их очень много и они достаточно протяженные - LINE-элемент стандартный порядка 7 000. За счёт этого могут происходить совершенно разные события, в зависимости от того, как эти повторы расположены. Допустим, рассмотрим хромосому, в которой 2 транспозона в одинаковой ориентации располагаются. За счёт рекомбинации между этими повторами происходит делеция части между ними. Если повторы инвертированы, произойдёт инверсия. Если повторы располагаются на различных хромосомах, могут происходить рекомбинации между копиями одного и того же транспозона, которые в разных местах расположены. В результате мы получаем транслокацию одной хромосомы на другую, а во второй хромосоме происходит делеция. И все эти процессы достаточно легко происходят и во многих случаях они не имеют негативного эффекта на функционирование генома. Но это всё приводит и к дефектам во время мейоза. Как правило, такие перестройки сопровождаются ещё и диплоидизацией или анеуплоидизацией, когда идёт дупликация. Потому что при появлении такой перестройки, когда идёт следующий мейоз, с такими хромосомами нормальные не могут сегрегировать. Поэтому выживают только те гаметы, в которых произойдёт ещё одна абберация, т.е. произойдёт нерасхождение и в результате они смогут спариться нормально в уже дуплицированные хромосомы. И эти вещи не очень часто происходят, хотя сама рекомбинация происходит с достаточно высокой частотой. Допустим, на бактериях, где нет таких ограничений, поскольку у них нет мейоза, вы можете легко наблюдать такие вещи. Я сталкивался с не очень удобными штуками. Транспозон TNT. У него по концам 2 повтора по 1 500 н.п. (Загадочный рисунок). Если он встроен в геном, то он встроен в строго определённой ориентации. Если вы захотите вдруг определить ориентацию такого транспозона, то у вас возникнут проблемы. Самый простой вариант – это поставить ПЦР. Допустим, вы знаете, в каком локусе он встроен. Вы берёте 2 праймера – один вот здесь и второй праймер к началу гена кономицинрезистентности. Но поскольку 2 альтернативных варианта – такая ориентация и ориентация совершенно противоположная, вы берёте ещё вот этот праймер. Но результаты с этими праймерами будут совершенно одинаковыми. Между IS-элементами будет происходить рекомбинация. Когда выделяете ДНК из бактериальных клеток, где их миллиард, то… Когда я пытался оценить какой процент клеток с перевёрнутой версией транспозона, получилось около 0,1%. Очень высокий. Эти процессы инверсии идут даже при относительно небольшой гомологии – 1,5 т.п.н. Когда я работал с мини-транспозонами, там по 20 нуклеотидных пар на концах – это считается, что за пределами того расстояния, которое распознаёт recA белок, который инициирует гомологичную рекомбинацию, всё равно с очень низкой вероятностью они переворачиваются, всё равно идёт рекомбинация, но там уже частоты порядка 10-8.(это степень). Даже коротенькие – пара десятков нуклеотидов. А у эукариот пара десятков нуклеотидов отлично рекомбинируется. У дрожжей очень эффективно идёт рекомбинация именно с короткими областями гомологии. Сами процессы рекомбинации идут с высокой частотой, они могут фиксироваться в геноме, когда на такую перестройку накладывается еще абберация в процессе мейоза. При межвидовых скрещиваниях тоже очень часто такие штуки фиксируются. Там ещё дополнительный прессинг на диплоидизацию.

Структура центромерных и теломерных частей хромосомы. Без них невозможно нормальное поддержание и нормальная репликация линейных хромосом. Наверное, у половины прокариотических организмов геном линейный. И в подавляющем большинстве у них несколько хромосом. Спирохеты все линейные, агробактерии имеют две хромосомы, и одна из них линейная, есть организмы прокариотические с четырьмя хромосомами. Так что это всеобщее заблуждение, что геном прокариот – одна кольцевая хромосома.

Центромеры в классическом представлении у прокариот нет, а теломеры есть во всех случаях, когда геном линейный. Только у хлебных дрожжей структура центромеры точно известна. Единственный эукариотический геном, у которого центромера очень коротенькая – менее 100 н.п., поэтому точно известна её структура. Это АТ-богатая последовательность, а по концам её консервативные участки – один, второй и третий. Каждый из них выполняет свою функцию. (Слайд). Центормера – это область прикрепления микротрубочек веретена деления. В случае дрожжевых центромер чётко показывается, какие белки где связываются. Один мультимер белка связывается с центральной областью, различные белки связываются с левой и правой областью, получается такой изогнутый комплекс, к которому прикрепляются микротрубочки. Суть любой центромеры в том же и заключается – чтобы прикрепить аппарат деления, однако их, как правило, не удаётся минимизировать до сотни нуклеотидов. Минимальный размер центромер, который в большинстве геномов детектируется, измеряется, как правило, десятками тысяч н. пар, а есть организмы, у которых таких фиксированных центромер нет вообще, а микротрубоки крепятся по всей длине хромосомы. Область ДНК, которая входит в центромеру имеет определённую структуру. Помимо тех компонентов, которые нужны для аппарата деления, в центромеру обычно напихивается достаточно большое количество МГЭ и всякой прочей балластной ДНК, поэтому есть какое-то эволюциооное давление на увеличение размера центромеры. Дрожжам как-то удалось справиться, а большинство организмов не может.

Теломера (слайд) это абсолютно необходимая структура линейной хромосомы. Кольцевую хромосому удобно реплицировать – одна репликативная вилка может проехать по кругу несколько раз, и это приведёт к репликации хромосомы. Репликация: лидирующая цепь – с точки origin начали и поехали до самого конца, а запаздывающая цепь должна реинициироваться за счёт фрагментов Оказаки через опредеденное количество нуклеотидов. Для эукариот это расстояние около 100 – 200 н.п. На лидирующей цепи копия матрицы синтезируется легко до конца, а запаздывющую цепь завершить клетка не может, потому что фрагменты Оказаки прикрепить некуда. В результате остается 100-150 нуклеотидов недореплицироавано. Соответственно, клетка должна иметь какой-то механизм репликации этого конца, либо при делении эта часть будет утрачиваться, и хромосома будет укорачиваться с каждым делением. Этого не происходит нигде, кроме как в соматических клетках человека. Теломеры у большинства организмов представлены различными коротенькими простыми повторами (Слайд). Эукариоты и прокариоты используют разный механизм репликации теломерных концов. У прокариот эти концы, как правило, ковалентно замкнуты стандартной сахарофосфатной связью. На конце получается небольшая петля, и при такой организации проблем в с репликацией нет. Потом можно включить стандартный механизм репарации, который вместе с полимеразой-1 достроит небольшую брешь. Почему эукариоты не используют такой механизм – неизвестно. Теломера – это несколько тысяч повторов, причём на одной из нитей всё-таки остается одноцепочечный участок, который в принципе невозможно никак реплицировать. Он защищен путём образования кольцевой структуры – Т-петли, которая образуется за счёт того, что этот однонитевой участок вытесняет гомологичный повтор, с такой петельной структурой связывается белковый комплекс, как минимум 2 белка, который стабилизирует структуру и защищает однонитевой участок. Такая теломерная структура достаточно стабильна. У различных организмов вариации есть, но, как правило, свободного линейного конца нет и быть не может, потому что это субстрат для действия нуклеаз. Аппарат, который обеспечивает дорепликацию теломер, имеет непосредственное отношение к ретротранспозонам, поскольку теломераза – это обратная транскриптаза с чётко прослеживающейся гомологией с ретровирусными ферментами. Эукариоты пошли по пути, отличному от прокариотического. Прокариоты пытаются реплицировать теломеры, эукариоты не пытаются стандартной клеточной репликацией реплицировать теломеру, она каждый раз укорачивается, и специальная ферментная система затем наращивает коротенькие повторы. Теломераза работает т.о., что поддерживается стабильная длина этих повторов. Если теломера сильно укоротилась, теломераза активируется и больше этих повторов добавляет, если теломера длинная, то теломераза не активируется. Теломераза – один из многих рибонуклеопротеидов в клетке, которые помимо белковой части имеют ещё небольшую РНК в составе. Эта молкула РНК выступает в качестве матрицы для достройки теломерных повторов. (Слайд). мРНК спаривается с теломерным повтором, поскольку это комплиментарная последовательность, в результате у нас есть затравочный 3`конец, теломераза использует его и за счёт обратно-транскриптазной активности достраивает 1 повтор теломерный. Затем двигается дальше, идёт достройка повтора, когда он достроен, теломераза перемещается к следующему повтору. Этот процесс повторяется многократно. В результате получается интересная ситуация: теломераза не достраивает ту нить, которую нужно достраивать, она достраивает другую нить, удлиняется цепь, которая и так длиннее. Здесь смысл есть: когда длина одноцепочечного участка достаточна, здесь может быть инициирован фрагмент Оказаки. В тех случаях, когда этот фермент не работает, с каждым клеточным делением теломеры укорачиваются, изаканчивается это тем, что уже не теломеры укорачиваются, а хромосомная последовательность, что приводит клетку к катастрофе. Когда такое укорачивание затронет существенные для жизнедеятельности клетки гены, клетка либо погибнет, либо может претерпевать раковое перерождение. По этой причине соматические клетки человека невозможно поддерживать в культуре.

ПРОКАРИОТИЧЕСКИЕ ГЕНОМЫ

Есть существенное отличие между прокариотами и эукариотами. Прокариоты гораздо более разнообразны и гораздо более мобильны. Мобильность не надо путать с эволюционной изменчивостью, потому что за счёт прерывистости генов эукариоты обеспечивают гораздо более высокую рекомбинационную изменчивость, прокариоты этого сделать не могут, потому что у них гены непрерывные. Зато у них есть механизм, который обеспечивает достаточно быструю приспособляемость, связанный с горизонтальным переносом генов, межвидовым, что абсолютно исключено у большинства эукариот. Такая мобильность эукариотического генома создаёт сильные проблемы для попыток систематизировать эти организмы. Вся классификация, которую вам дают на микробиологии, она выеденного яйца не стоит, потому что нету такого понятия, как бактериальный вид. Есть огромный пул прокариотических генов, в котором гены достаточно свободно перемещаются между видами. Поэтому говорить о том, что есть какой-то бактериальный вид, не приходится. Это просто какая-то удобная концепция человеческая, а в реальной природе есть какое-то сообщество прокариотических организмов, в котором относительно свободно перемещаются гены в соответствии с потребностями, которые перед этими организмами стоят.

О геноме информацию можно представлять в целом ряде форматов и говорить достаточно сложно о том, что из себя геном представляет, потому что слишком много данных можно об этом геноме предложить для вашего усвоения. Вы просто должны иметь общее представление о размере бактериального генома, о том количестве генов, которые в нём присутствуют. Когда мы говорим о генах, мы в первую очередь говорим о генах, кодирующих белок, потому что гены бывают и не кодирующие белок. Это отдельный класс, есть различные регуляторные гены, рРНК гены, тРНК гены. Только те гены, которые белок кодируют, дают представление о сложности организма, о сложности его молекулярной биологии. И должно быть у вас представление, какой % балластной ДНК, в первую очередь – МГЭ.

На сегодняшний день количество бактериальных геномов с известной нуклеотидной последовательностью превысило 1000. Все их анализировать смысла нет, потому что общая картина начала складываться лет 10 назад, когда количество изученных геномов измерялось одним десятком. Но всё время появляются интересные геномы, и о некоторых придётся изложить более подробную информацию. Заключения об общей организации генома можно представить в графической форме. Статьи, которые выходят о геноме, в обязательном порядке содержат такой график, это такая неписанная договорённость. Как правило, различные функциональные участки генома помечаются каким-то цветом. Функциональные участки: гены, транспозоны, гены рРНК, гены тРНК. И общие характеристики генома, такие, как ГЦ-состав, которые очень варьируют, как правило, по геному. (Слайд). Геном представляют таким образом, чтобы точка начала репликации, т.е. цифра 1 – это один из нуклеотидов, с которых начинается репликация. И соответственно, с другой стороны генома будет точка завершения репликации. Для большинства геномов в той или иной степени выражена закономерность: гены располагаются не произвольным образом по геному, а в зависимости от того, в какой части хромосомы они расположены, они будут считываться либо с одной цепи, либо с другой. (Загадочный рисунок). Поскольку репликаза – достаточно крупный мультибелковый комплекс, достаточно много белков должны координировано работать, и когда идёт репликация, то естественно, что никакой другой белок в эту область доступ получить не может. РНК-полимераза – тоже крупный мультибелковый комплекс, который тоже претендует на эксклюзивное владение участком ДНК, с которым он работает. Т. е. транскрипция и репликация белка – это вещи взаимоисключающиеся. Если представить ситуацию, когда транскрипция идёт в одну сторону, а репликация - в другую. Получается, что один из комплексов должен диссоциировать и отсоединиться от матрицы, чтобы либо тот, либо другой процессы были завершены. Диссоциировать, конечно, должна РНК-полимераза, потому, что ДНК-полимераза - это очень процессивный фермент, который не должен останавливаться, по крайней мере, пока не будет повреждении ДНК, которое потребует репарации. Она не останавливается, она выкидывает к чёртовой матери РНК-полимеразу и это накладывает ограничения на транскрипцию. Если транскрипция идёт в другую сторону, никаких проблем нет. Репликаза быстрее движется, она догоняет РНК-полимеразу, РНК-полимераза просто заканчивает транскрипцию, отсоединяется и не начинает следующий цикл транскрипции, пока не пройдёт репликативный комплекс. В зависимости, от того, как организованы эти ферменты, эта проблема выражена более или менее ярко, поэтому в различных геномах будет по-разному выражена интенсивность этих процессов. В некоторых геномах почти одинаковое количество генов на двух противоположных цепях, но абсолютно одинакового количества никогда нет. Всегда есть предпочтения. В одной половине хромосомы (её ещё реплихорой называют) гены преимущественно располагаются на одной цепочке, в другой половине - на противоположной. В связи с такой организацией, поскольку кодирующая последовательность располагается на одной цепи, а некодирующая – на другой, есть ещё один интересный показатель, так называемый ГЦ-перекос. Определяется по формуле: (Г -Ц)/(Г+Ц). Это просто отражение нуклеотидного состава, процента ГЦ-пар на двух комплиментарных цепях. Если полностью случайная последовательность ДНК, то это соотношение, как правило, равно 0. Если оно не случайное, то будет наблюдаться ГЦ-перекос либо в одну сторону, либо в другую. В какую сторону – сказать сложно, это зависит от кодонового состава. Неслучайный состав будет в кодирующей последовательности. Когда гены располагются на одной цепочке, перекос будет в одну сторону, когда на другой – в другую. Точку старта, инициации и терминации репликации как раз определяют по ГЦ- перекосу. Прочие количественные показатели можете потом сами почитать. Некоторые графики могут показывать расположение МГЭ, некоторые – расположение тРНК, рРНК. Сам ГЦ-состав генома – очень важная характеристика. Для прокариот очень интенсивно идут процессы горизонтального переноса. ГЦ-состав генома организма – это величина постоянная, которая связана с тем, каким образом идут в основном репарационные процессы, в зависимости, от того, какая система репарации более эффективна. Репарация всегда вносит небольшую асимметричность в содержание различных оснований в геноме. Затем, после того, как такая асимметричность уже возникает, уже видоизменяются ферменты, поскольку от этого показателя сильно зависят процессы, которые связаны с метаболизмом ДНК, поскольку требуется всегда плавление 2-цепочечной структуры, чем больше ГЦ-пар, тем с большим трудом идёт плавление. Сложнее инициировать транскрипцию и репликацию, соответственно должны быть модифицированы ферменты, которые за эти процессы отвечают. И наоборот – когда меньше ГЦ-пар это протекает значительно проще. Но АТ-богатый геном тоже невыгоден – поцелому ряду причин: и менее стабильна такая структура и т. д. В идеале должна быть золотая середина, но такого никогда нет, геном всегда или чуть-чуть АТ-богатый, или чуть-чуть ГЦ-богатый, бывают экстремальные случаи. У малярийного плазмодия геном на 81% состоит из АТ-пар, у стрептомицетов под 70% ГЦ-пар. Если в геном попадает чужеродная ДНК за счёт горизонтального переноса, то там процент ГЦ-пар будет другой. ( Считать надо, конечно, не на десятках н.п., а на тысячах). Если посмотреть, как по геному варьируют разные участки, можно очень четко увидеть фрагменты генома чужеродного, которые за счет горизонтального переноса сравнительно недавно попали в этот геном. (Слайд). Бывают и мелкие участки – это либо МГЭ, либо кодирующие белок гены, принесенные за счёт горизонтального переноса, но уже закрепились, и идёт их фиксация, адаптация и выравнивание ГЦ-состава. А крупные участки – это, как правило, бактериофаги, почти всегда умеренные бактериофаги, которые какое-то время сидят в геноме, могут из него иногда вырезаться, но с течением времени они там закрепляются и остаются надолго.

Лекция 11.

Бактериальные геномы.

Геном бактерии Deinococcus radiodurans, интересна история её открытия. Снабжение солдат продуктами всегда сопряжено с проблемами, значитальная часть армейских запасов – консервы. Вдруг в 50-х годах стали взрываться консервы, ядерные исследования, физики предложили простериализовать. А через некоторое время стали взрываться и эти простериализованные банки, позвали биологов - те проверили, оказалось, что в банках живёт эта самая бактерия, которая выдерживает любое повреждающее ДНК воздействие, и целый ряд прочих физико-химических воздействий - высушивание, вакуум. Возникли спекуляции на тему того, что это имена та «спора жизни», бактерия, прилетевшая к нам из космоса.

Геном этой бактерии довольно давно определён. В этом геноме содержаться все известные гены, отвечающие за репарационные процессы, причём значительная их часть повторена несколько раз (Rec-гены). В геноме Deinococcus есть система репарации двухцепочечных разрывов, что нетипично для бактерий. Хромосомы у них, как правило, в нескольких копиях в клетки поддерживается. Геном – 4 репликона различного размера, самый большой из них 2,6 млн н.п., второй 400 000 н.п. , эти два репликона называются хромосомами, есть ещё два репликона, которые называются плазмидами. Различия между хромосомами и плазмидами довольно условные, но считается, что если убрать репликон и клетки и клетка живёт, то это плазмида, если убрать невозможно - хромосома. Значительная часть генов репарации в самом большом репликоне. Deinococcus входит в одну группу с Thermus, значительная часть другой хромосомы досталась ему от Thermus, скорее всего один из репликонов за счёт горизонтального переноса был перенесен. Понятно, что были реорганизации, большая часть генов мигрировала на большую из хромосом, потому как у них различные системы репликации. У одной из хромосом система репликации, как у E.coli , у меньшей из хромосом система репликации плазмидного типа, есть par-гены. Но здесь находятся жизненно важные функции. Высокое содержание ГЦ-пар.

Thermotaga maritima – ещё одна бактерия, которая достаточно рано секвенировали геном, термофильная бактерия, большой спектр ферментов, отвечающих за метаболизм различных полисахаридов, так был интерес биотехнологов изучить эту бактерию, как потенциального продуцента термостабильных ферментов. Правда биотехнологии не используют её, но выяснились интересные особенности генома. Нормальная среда обитания этой бактерии – это глубоководные горячие источники, дно океана бедно организмами, нет света, первичной продукции. Жизнь сосредоточена возле подводных вулканов – можно использовать источники энергии, идёт хемолитотрофных синтез, фиксируется углерод. Возникает экологическая ниша, первичные продуценты, какие-то животные. Достаточно токсическая среда, сера, сероводород, в основном там обитают Археи. Около четверти генома имеют высокую гомологию с Археями. Пример достаточно эффективного горизонтального переноса между различными надцарствами. Иллюстрация того, что прокариотическая организация не накладывает никаких ограничений, позволяет свободно мигрировать генетической информации.

16% генов гомологии с Архебактериями, менее 2 млн н.п. свободноживущий организм.

Aquifex aeolicus - cамый маленький – абсолютно минимальный геном – хемолитоавтотроф. 1.5 млн н.п. 1,5 генов. 93% кодирующей ДНК.

Enterobacteriaceae в целом гораздно интереснее, чем экзотические организмы по той причине, что их легче культивировать, изучать. Обитают при плотности популяции 10 -10 в ЖКТ, за счёт скученности обмен генетической информацией тоже активно идёт, можно отчетливо проследить. Базовая часть хромосомы, нашпигованная МГЭ. Несколько интегрированных геномов бактериофагов. Штамм К12 имеет 7 лизогенных, часть являются реликтовыми и вырезаться не могут. Острова патогенности связаны с различными факторами вирулентности, они добавляются к основному геному блоками. Например, система секреции третьего типа – весь секреторный аппарат плюс несколько эффекторов находится в пределах такого острова. Некоторые могут нести несколько систем секреции третьего типа, как правило, первая секреторная система обеспечивает проникновение энтеропатогена через клетки кишечного эпителия, вторая нужна уже для его фиксации в макрофагах, например Yersinia. Поскольку клетки разные, нужны различные эффекторы для проникновения. Значительная часть факторов вирулентности может находиться на плазмидах. Например синтез энтеротоксина, гены адгезинов , гемолизины, колицины. Хотя колицины не имеют отношения к факторам вирулентности, но участвуют в подавлении другой микрофлоры. В том числе и гены антибиотикорезистентности они часто присутствуют на плазмидах. Транспозоны не показаны на картинке, но для энтеробактерий они не являются векторами переноса, обычно нужен какой-либо дополнительный вектор, либо бактериофаг, либо плазмида. Между двумя инвертированными повторами, если находится какая-то информация, в цис-положении транспозаза может обеспечить перемещение этой генетической информации, затем фаг или плазмида передать её в другую бактерию. Грамположительные бактерии имеют ещё так называемые коньюгативные транспозоны, которые могут самостоятельно обеспечивать перенос своей ДНК в другую клетку бактерии без участия дополнительных векторов. Механизм передачи по типу плазмидной ДНК с небольшой вариацией.

Острова патогенности. У E.coli большинство из них представляют собой редуцированные бактериофаги. На стадии показана структура резидентных криптических бактериофагов. Большая часть редукции происходит, делеция генов, кодирующих гены капсида. Остаются гены рекомбиназы, значительная часть Rec-генов E.coli имеет выраженное фаговое происхождение. Несколько стандартных систем рекомбинации существуют, например RecN и RecO имеют такое фаговое происхождение. Каким образом можно остров патогенности найти? Может быть интегрированная эписома, фрагмент, попавший за счёт трансформации. Наиболее яркое свойство – отличный ГЦ-состав острова патогенности. У каждой бактерии своё содержание ГЦ-пар Dinococcus radiodurans – 68%, для большинства энтеробактерий – около 50%. То есть чужеродняа ДНК будет первоначально отличаться по ГЦ-составу. Другой фактор – наличие генов, не являющихся бактериальными: генов мобильности, как правило локализованных по краям такой области острова патогенности, транспозазы, либо различные гены мобильности плазмид, либо фрагменты генов бактериофагов – интегразы, эксцизионные ферменты. Часто интеграция таких островов идёт по области гомологии, обеспечиваючивающейся генами тРНК, один из факторов их использования, их избыточность (под каждый кодон несколько генов, и под каждую аминокислоту несколько кодонов), то есть эти гены совершенно безболезненно могут быть инактивированы. Они могут быть инактивированы, а могут и не инактивироваться, так как входящий фрагмент тоже имеет гены тРНК, по ним и идёт интеграция. После интеграции происходит ряд событий, на примере интеграции резидентного умеренного бактериофага. На слайде показана цепь событий .

1 стадия – весь геном бактериофага встраивается в определенную область за счет рекомбинации с геном тРНК, соответствующий фрагмент может быть вырезан. Баланс между интеграцией и эксцизией, но как только один из генов int или xis инактивируется или если в геноме делетирован участок, по которому идёт сайтспецифичекая рекомбинация. Со временем идёт уменьшение, инактивируются функции абсолютно клетке ненужные, так как у бактерий есть жесткий прессинг на удаление ненужной ДНК. Фаговые гены превращаются в псевдогены, происходят делеции различной длины. Значительная часть фагов может привнести какой-то хромосомный геном путём трансдукции. В конце концов, мы имеем видоизмененную ДНК, выравнивается ГЦ-состав, протекание нуклеотидных замен, системы репарации. На сегодняшний день секвенировано около сотни бактериальных геномов различных видов энтеробактерий, внутри каждого вида несколько штаммов. Первыми E.coli, однако геном штамма К12 довольно скучен, никаких островов патогенности нет, тщательный анализ других геномов, в том числе энтеропатогенных штаммов E.coli показывает, что есть базовый каркас, в который были добавлены свои участки ДНК. На слайде сравнение двух геномов энтеробактерий - есть синтеничные участки, есть совсем неродственные участки, есть делеции. Считается, что каркас около 4 млн н.п. От 4,6 до 5 с небольшим млн н.п.

До того как были секвенированы геномы Salmonella typhi и typhimurium считалось, что это различные организмы, оказалось, что разница между ними небольшие. Сейчас они объединены вместе в Salmonella enterica и считаются различными сероварами. У них есть одна и та же хромосома, но typhimurium содержит одну плазмиду , typhi – две. Немного различные спектр хозяев. То что Salmonella enterica серовар typhi является более специализированным, отражается даже в том, что у неё много псевдогенов. Патоген занимает удобную нишу, эволюция по пути специализации к одному виду, выбрасываются гены, которые не нужны. То же самое можно говорить о Yersinia. Y.pestis более специализированный вид, Y.entеrocoliticа и Y.pseudotuberculosum – менее. В целом патогены присутствуют практически в любых гуппах организмов, Грамотрицательные, в каждом семействе можно найти и патогенные, и сапрофитные и симбиотические. В пределах энтеробактерий есть E.coli – сапрофит, есть патогены – Yersinia, Salmonella enterica , есть фитопатогены – Erwinia, есть довольно интересные облигатные эндосимбионты насекомых – тли и мухи Цеце. Очень плотный эндосимбиоз, ни насекомое, ни бактерия не могу друг без друга. Необходима и для эндосимбиоза и для паразитизма – система прикрепления в организме, поверхностные структуры модифицированы, чтобы снизить иммунный ответ. Даже Rizobium имеет систему секреции третьего типа, любой субстрат, который транспортируется в клетку всегда распознаётся растительной клеткой есть супрессоры реакции гиперчувствительности. Для патогенов животных большое значение имеет изменчивость поверхностынх структур, то что находится на поверхности клетки должно видоизменяться очень-очень быстро. Пару слов о различных поверхностных структурах. Здесь в качестве примера приведены опероны, отвечающие за синтез пилей, их около десятка, и ССТТ. Есть подвид, отвечающих за синтез жгутика, а флагеллин довольно важный иммуноген, и есть СС, отвечающая за взаимодействие с патогенном. В случае Yersinia есть хромосомный вариант ССТТ и плазмидный вариант ССТТ. Два острова патогенности – один на хромосоме, другой на плазмиде, плюс два оперона, отвечающие за биосинтез жгутиков, их вообще три, но один разорван и полноценный функциональный флагеллин не кодируется. Две системы секреции, обеспечивающие синтез факторов вирулентности, нужны для взаимодействия с растением, а наличие двух жгутиковых систем – для изменения поверхностного антигена, можно обмануть иммунную систему, ту же самую функцию несет большое количество оперонов, кодирующих синтез пилей, отвечают за адгезивные свойства. Возможно изменять поверхностные свойства. Bacteroides в этом плане интересен тем, что очень активно идёт видоизменения активных структур. Основной фактор – переключение состава внеклеточных полисахаридов, огромное количество генов, синтезирует капсулу. Все гены собраны в опероны, перед каждым из оперонов генетический выключатель, два промотора конститутивные (а может и не выяснен механизм регуляции), сайт гомологии для рекомбиназы по обе стороны промотора, может его переворачивать, промотор то включен, то выключен за счёт сайт-специфической рекомбинации. Ферменты системы рестрикции-модификации. Такого же плана структуры характерны для Neisseria, которая быстро меняет поверхностные антигены. Ярче выражены у патогенов животных. В ходе одного заболевания даже меняются поверхностные антигены, обманывая иммунную систему.

Характерна редуктивная эволюция, даже Mycobacterium tuberculozis , которая имеет довольно 4 млн н.п 4000 с небольшим генов, медленно растут, медленно развивается инфекция. Mycobacterium leprае пошли ещё дальше по этому пути, редукция зашла довольно далеко, около половины псевдогены, 1200 псевдогенов, инактивированы гены, кодирующие липополисахариды, отвечающие за клеточную стенку, кислотоустойчивость, разлчные биосинтетические пути, в результате скорость роста очень низкая, вот и проказа странная болезнь, десятки лет до проявления симптомов. Экстримальный примеры у грамположительных бактерий _ различные микоплазмы, отдаленные родственники микобактерий. Около 500 генов, но и в порядке Микоплазм различная редукция. Например Mycoplazma pneumonia – около 1 млн н.п. , микоплазмы даже с чуть более 1 млн н.п. Если говорить о случаях симбиоза и облигатного паразитизма, всегда возникает своего рода взаимозависимость, патогены мухи Тли и Цеце. Около 600 000 н.п. – только базовый метаболизм нуклеиновых кислот плюс трансляционный аппарат, пути биосинтеза аминокислот , практически урезаны системы, отвечающие за синтез кофакторов, основных витаминов. У симбионта мухи Цеце наоборот – синтез большинства витаминов, но урезан синтез аминокислот. У хозяина есть специальные клетки, где содержаться бактерии, бактериоцисты, то есть даже без них нормально не развивается организм. Редукция генома идёт интересно, самый простой путь – гомологичная рекомбинация. Самый простой вариант – это транспозоны, если они расположены в одинаковой ориентации, то рекомбинация между ними обеспечивает делецию фрагмента хромосомы. То есть в геноме остаётся либо ноль, либо один транспозон. Этому одному транспозону реокмбинировать уже не с кем, первыми исчезают гены сенсорных систем, также различные системы репараций, так как резкое воздействие негативно. Это накладывает отпечаток на генм, если редукция зашла далеко резко падает содержание ГЦ-пар. Чем больше АТ-пар, тем легче идут процессы транскрипции и трансляции, однако менее стабильна ДНК, но патогену это не так важно. Самый экстримальный пример – малярийный плазмодий (19% ГЦ-пар).

Эукариотические геномы. Дрожжи.

В целом, эукариоты очень разнообразны. Большая часть одноклеточных эукариот адекватно описывается таксонами уровня Царства. Есть много одноклеточных водорослей , Хризофитовыые, они идут как класс. Но эти водоросли, хролопласт – пример вторичного эндосимбиоза, этот примитивный эукариотический организм поглотил другой одноклеточный эукариотический организм. Сначала был эукариотический эндосимбиоз одноклеточного эукариотического нефотосинтезирующего организима с одноклеточным эукариотическим фотосинтезирующим организимом, с течение времени шла интенсивная редукция генома эндосимбионта, часть генов мигрировала в геном хозяина, но по крайней мере в некоторых видах сохранилось даже редуцированное ядро эндосимбионта, так называемый, нуклеоморф, часть была нуклеоморфов секвенирована. Оказалось, что это стандартный эукариотический геном, похожий на эукариотический, похожий на прокариотический тем, что лишней балластной ДНК нет, гены перекрываются, около 1.5 млн. Существует два нуклеоморфа, различные эндосимбиозы. Плазмодий несёт интересную органеллу – апикопласт, тип Апикомплекса. Апикопласт отвечает за метаболизм различных соединений. Хролопласт Криптофитовых и апикопласт ограничены четырьми мембранами. Одна внешняя клеточная мембрана, вторая мембраны эндосимбиоза и две мембраны хлоропласта. В этом случае протоплазмы эндосимбионта практически не остаётся, даже нуклеоморф где-то сбоку лежит. В апикопласте ядра не сохранилось, однако наличие четырёх мембран подчеркивает происхождение. Если детально исследовать как работают молекулярно-генетические механизмы таких интересных одноклеточных эукариот, тоже много чудес получится. Есть различные водоросли, у которых и нормального митоза нет, например Dinoflagellata, у инфузорий интересно идёт деление.

Дрожжи – удобный модельный объект, это редуцированные аскомицеты. Два наиболее изученных вида дрожжей – Schizosacharomyces pombe и Sacharomyces cerevisiae, оба одноклеточные, имеют похожие геномы, между ними полмиллиарда до миллиарда по различным оценкам лет эволюции. Понятно, что был какой-то общий аскомицетный предок, от которого эти виды произошли. Пример филогенетического древа, эти грибы родственны другим грибам, другие эукариоты довольно обособлены. Основный характеристики геномов на первый взгляд схожи. У Sacharomyces cerevisiae 16 хромосом, у Schizosacharomyces pombe их всего 3. Число генов также существенно различается, первые оценки были существенно больше для обоих видов однако с каждым годом число кодирующих генов уменьшается. Около 5500 для Schizosacharomyces pombe, для Sacharomyces cerevisiae около 5000 генов. Существенные отличия начинаются, если посмотреть, сколько генов с интронами, у Schizosacharomyces pombe стандарный эукариотический геном, значительная часть генов (43%) с интронами, в случае, если интроны есть, он может быть один, может быть много. В случае Sacharomyces cerevisiae по различным оценкам от 3 до 5 % генов с интронами, во всех случаях кодирующая последовательность никогда не прерывается, когда интрон есть он в самом начале 5' некодирующей области располагается. В целом плотность генов от 1 гена на 2,5 тысячи нуклеотидов. Если посмотреть, какой процент генома кодирует белки, то это порядок 60-70 %. Однако помимо генов, кодирующих белки, есть гены тРНК, есть гены рРНК, могут быть локализованы в виде тандемных повторов, могут быть разбросанными по геному, быть локализованными в центромерных и теломерных областях, наконец есть гены малых ядерных РНК, какое-то количество транспозонов. У пивных дрожжей меньше, у хлебных больше, есть также какое-то количество длинных концевых повторов, эта часть транспозонов ретровирусные, в дрожжах очень эффективно идёт гомологичная рекомбинация, поскольку ретротранспозоны ограничены двумя прямыми повторами, рекомбинация между ними выбрасывает центральную часть ретротранспозона, остаётся одиночный повтор, у дрожжей они называются дельта-последовательности. Существенное различие между этими дрожжами состоит в строении их теломерных и центромерных областей. У Sacharomyces cerevisiae достаточно просто устроенная центромера, менее сотни н.п., у пивных дрожжей строение центромеры близко к строению стандартной центромеры эукариот - это несколько десятков тысяч н.п. , в которых есть различные наборы различных повторов, часть из них так и называется – центромерные повторы, которые больше нигде не встречаются, скорее всего именно с этими повторами взаимодействуют белки, отвечающие за формирование веретена деления, присутствуют гены тРНК (показаны на слайде значками) и во многих случаях транспозоны присутствуют, у дрожжей это не характерно, так как их мало в геноме, у других эукариот они присутствуют.

Пару слов о геномном дрожжевом проекте. Два дрожжевых генома совершенно в разное время секвенировали, Sacharomyces cerevisiae были первым секвенированным эукариотическим организмом, а Schizosacharomyces pombe секвенировали в районе 2000 года (Пол Нёрс , Нобелевская премия), интерес к сиквенсу пивных дрожжей связан с тем, что именно на них исследовалось клеточное деление, Предстояло выяснить, какие гены деления являются общими, выделить ключевые гены деления, характерные для большинства эукариот. Однако не нашлось генов, кроме тех, которые были выявлены классическими генетическими методами. Первый дрожжевой геном сделан был ещё классическим подходом - составление сначала физических карт всех 16 хромосом, которые показали наличие большого числа дубликаций в геноме, хромосомы были розданы по лабораториям, по всему миру занимались секвенированием этого генома, однако тогда ещё не во всех лабораториях стояли автоматические флюорисцентные секвенаторы, секвенирование делалось вручную на ручных секвенаторах, выходило очень много диссертаций с сиквенсом и характеристикой отдельных хромосом. В итоговой статье получилось 600 авторов. В ходе секвенирования шёл активный обмен информацией между ключевыми группами, сформировалось Дрожжевое сообщество. Смысл этого проекта был двояким – получить сам сиквенс и сформировать коллектив, который дальше бы занимался дальнейшими исследованиями, выяснением функций генов.

Schizosacharomyces pombe имеют стандартные теломеры и теломеразу, Sacharomyces cerevisiae такового фермента, как теломераза не имеют. Считается, что один из Ty-транспозонов (Ty-5) взял на себя эту функцию, то есть обратная транскриптаза отвечает за репликацию концов 16 хромосом. Была надежда, что процессы старения на дрожжах можно будет активно изучать, однако их можно изучать лишь на пивных дрожжах лишь с большой натяжкой, на Sacharomyces cerevisiae это невозможно, у них просто нет фермента теломеразы.