1.2.3.Вторичная структура биополимеров

Вторичная структура белков

Рис. 3.9. Стержневая модель -спирали (слева) и схематическое представление хода пептидного остова (справа). Водородные связи представлены пунктиром на левой модели и тонкими линиями — на правой; боковые радикалы показаны сферами.

Одним из основных элементов вторичной структуры белков является ‑спираль. Это — правая спираль (предложена Лайнусом Полингом и Робертом Кори), содержащая 3,6 аминокислотного остатка на виток и с периодом повторяемости 5,4 Å (Рис. 3 .9). Полипептидный остов образует плотные витки вокруг длинной оси молекулы, тогда как боковые радикалы выступают наружу. Спираль удерживается водородными связями между группами N-H одной пептидной связи и кислородом группы С=О, принадлежащей другой пептидной связи, расположенной через четыре аминокислотных остатка над первой в следующем витке спирали.

Рис. 3.10. -Складка. А — палочковая модель, Б — та же структура, повернутая на 180°, В — схематическое изображение -складки. Во всех структурах боковые радикалы представлены сферами.

Вторым элементом вторичной структуры белков является -конформация (Рис. 3 .10). Остов полипептидной цепи в -конформации вытянут таким образом, что имеет уже не спиральную, а зигзагообразную, гофрированную форму. В идеализированной полностью вытянутой структуре углы  и  равны 180°. Для ‑конформации характерно отсутствие внутрицепочечных водородных связей. Вместо них образуются межцепочечные водородные связи между пептидными группами соседних полипептидных цепей (Рис. 3 .10).

Обычно, но необязательно, в -конформации соседние полипептидные связи направлены в противоположные стороны, то есть имеют антипараллельную ориентацию. Для того, чтобы соседние участки белковой последовательности расположились в ориентации, благоприятствующей образованию межцепочечных водородных связей, между ними должен находится неструктурированный участок, способный образовать -изгиб (хорошо виден на Рис. 3 .11).

Какую именно конформацию принимают участки полипептидной цепи (-спираль, ‑складку, -изгиб или остаются неструктурированными) в значительной степени определяется первичной последовательностью полипептидной цепи.

Вторичная структура нуклеиновых кислот

Рис. 3.11. Три -складки, образовавшие -слой (фрагмент белка актина). Стрелками показано направление от N- к С-концу, тонкими линиями — водородные связи. Хорошо виден -изгиб между первым и вторым (слева) -слоями.

К началу пятидесятых годов уже были известны основные особенности строения ДНК. В лаборатории Александра Тодда было определено химическое строение ДНК (Рис. 3 .4). Экспериментально было показано, что число пиримидиновых оснований в ДНК всегда в точности равно числу пуриновых оснований, а число аденинов всегда равно числу тиминов и число гуанинов – числу цитозинов (правило Чаргаффа). Наконец, Розалинда Франклин методом рентгено-структурного анализа показала, что фосфатные группы находятся снаружи структуры, а нуклеиновые основания спрятаны внутри. Однако разрозненные элементы мозаики никак складывались в целостную структурную картину. Это удалось сделать Джеймсу Уотсону и Френсису Крику. В 1953 г. они предложили модель двойной спирали ДНК (за эту работу они в 1962 г. получили Нобелевскую премию), положившую начало бурному развитию молекулярной генетики.

Заслуга Уотсона и Крика состоит именно в том, что они предложили единственно правильную схему спаривания оснований (Рис. 3 .12), которая впоследствии получила название уотсон-криковского спаривания.

Из рисунка очевидно, что предложенные пары естественным образом объясняют приведенные выше экспериментальные факты. То, что гликозидные связи оснований направлены в одну сторону определяет антипараллельную ориентацию полинуклеотидных цепей. Действительно, поскольку каждая цепь нуклеиновой кислоты представляет собой вектор (на Рис. 3 .4 показан стрелкой), возможны два типа двойной спирали – параллельная (направления цепей совпадают) и антипараллельная (цепи направлены в противоположные стороны). И та, и другая спираль обладают осью симметрии второго порядка. Однако в параллельной спирали ось симметрии совпадает с осью спирали, а в антипараллельной спирали осью симметрии является перпендикуляр к отрезку, связывающему С1-атомы, проходящий через середину этого отрезка и лежащий в плоскости пары. При повороте вокруг него на 180° гликозидная связь пуринового нуклеозида совмещается с гликозидной связью пиримидинового и наоборот. Оказалось, что только для антипараллельной спирали существуют изоморфные комплементарные (A:T и G:C) пары оснований. Таким образом, только в случае антипараллельной ориентации цепей возможна регулярная спираль для любой нуклеотидной последовательности со случайным чередованием мономерных единиц.

Рис. 3.12. Уотсон-криковские пары нуклеиновых оснований. Здесь и далее атомы водорода даны белым цветом, атомы углерода — черным, кислорода — темно-серым и азота — светлосерым. Водородные связи показаны пунктиром. Основания в АТ-паре связаны двумя, а в GC-паре — тремя водородными связями, поэтому GC-пары стабильнее АТ. Приведенные расстояния между гликозидными атомами углерода (C1) и угол, образуемый гликозидными связями с линией, соединяющей гликозидные атомы, показывают изоморфность уотсон-криковских пар. Вертикальной линией показана ось псевдосимметрии второго порядка.

Кроме того, только при антипараллельном спаривании могут образовываться шпильки, которые являются основным элементом вторичной структуры РНК. Антипараллельные регулярные спирали имеют ось симметрии (истинной относительно сахаро-фосфатного остова и псевдо относительно пар оснований) второго порядка, перпендикулярную к оси спирали. Важно, что симметрия спиралей разрешает изменения конформационных параметров в достаточно широких пределах. Так, ось спирали не обязательно должна проходить через центр пары, пары оснований могут быть наклонены к оси спирали, а основания в паре могут быть скручены в «пропеллер».

Двойную антипараллельную спираль (дуплекс) могут образовывать только комплементарные последовательности. Комплементарными называют такие последовательности нуклеотидов, в которых при образовании антипараллельной спирали все основания связаны в уотсон-криковские пары (т.е. против аденина оказывается тимин, а против гуанина — цитозин). Для последовательности 5‑AACTGTAG комплементарной будет последовательность 5-CTACAGTT (принято записывать последовательности начиная с 5-конца) и образующийся при спаривании дуплекс будет иметь строение . Очень важно отметить, что две комплементарные полинуклеотидные цепи двойной спирали ДНК не идентичны ни по последовательности оснований, ни по нуклеотидному составу. Если некоторая последовательность, как например, 5-AACTAGTT, может образовывать дуплекс сама с собой, то такую последовательность называют самокомплементарной.

Стабильность двойной спирали ДНК (ее часто называют дуплексом) определяется водородными связями между основаниями и так называемым стекинг-взаимодействием. Оно складывается из ван-дер-ваальсовых взаимодействий атомов, перекрывания -орбиталей нуклеиновых оснований и гидрофобных взаимодействий. Стекинг-взаимодействие удерживает пары оснований на оптимальном расстоянии (3,4 Å).

Таким образом, характерными особенностями уотсон-криковской модели ДНК были двуспиральность, антипараллельность цепей и уотсон-криковское спаривание оснований. Все структуры ДНК, которые сохраняют эти особенности, принято называть «каноническими». В настоящее время известны три канонических структуры ДНК: А-, В- и Z-формы.

Как мы видели выше для количественного описания конформации аминокислотного остатка в полипептидной цепи используют два двугранных угла —  и  . Однако для описания конформации нуклеотидного остатка в полинуклеотидной цепи необходимо знать 7 двугранных углов. Поэтому для описания спирали нуклеиновой кислоты удобнее использовать другой набор параметров, так называемые спиральные параметры:

1. Направление закручивания спирали. Спирали могу быть правыми или левыми. Правыми называют такие спирали, в которых при взгляде вдоль оси спирали каждый следующий элемент смещен относительно предыдущего по часовой стрелке.

2. Угол закручивания спирали, . Угол, образуемый С1–С1-отрезками соседних пар оснований (Рис. 3 .13А).

3. Число пар на оборот спирали, n. Этот параметр связан с предыдущим соотношением n = 360/.

4. Проекция пары на ось спирали, h. Расстояние между проекциями С1-атомов соседних по цепи нуклеозидов на ось спирали (Рис. 3 .13Б).

5. Высота витка спирали, Н. Связана с проекцией пары соотношением Н = h·n.

6. Сдвиг пары оснований, D. Расстояние от оси спирали до центра тяжести пары (Рис. 3 .13А).

7. Наклон пары оснований, . Угол между нормалью к паре и осью спирали (Рис. 3 .13Б).

Кроме перечисленных выше параметров спирали, к очень важным характеристикам структуры ДНК относятся конформация дезоксирибозного цикла и конформация гликозидной связи. В нуклеиновых кислотах встречаются две устойчивых конформации фуранозного цикла — С2-эндо- и С3-эндо-конформации (Error: Reference source not found). Наконец, существует два устойчивых состояния нуклеинового основания относительно сахарного остатка — анти и син (Error: Reference source not found).

Рис. 3.13. Параметры спирали ДНК. Приведен участок двойной спирали из двух пар оснований.

А — Проекция вдоль оси спирали, Б — проекция перпендикулярно оси спирали. Для удобства рассмотрения даны лишь атомы водорода, образующие водородные связи.

В-Форма ДНК

В-Форма является основной структурой ДНК, обеспечивающей хранение и передачу генетической информации. Именно В-форма находится в ядре клетки и участвует в репликации ДНК. В-форма никогда не встречается в двуспиральных участках РНК.

Это — правая спираль, все сахара которой имеют С2-эндо-конформацию, а основания — анти-конформацию. Пары оснований практически перпендикулярны оси спирали, а ось спирали проходит через центры тяжести пар (эти особенности строения хорошо видны на Рис. 3 .14). На виток спирали приходится 10 пар оснований ( = 36°). Высота витка (10 пар оснований) 34 Å. Отметим, что 3,4 Å является оптимальным расстоянием между плоскостями нуклеиновых оснований. Именно для этого расстояния энергия стекинг-взаимодействия максимальна.

Как видно из Рис. 3 .14, характерной особенностью В‑спирали является наличие двух различных желобов (бороздок). Один из них широкий и глубокий называют широким или большим желобом. В него выходят основные функциональные группы нуклеиновых оснований: О4 пиримидиновых оснований, N7 и 6‑NН₂ аденина, N7 и О6 гуанина.

Рис. 3.14. В-Форма ДНК. Приведена схематическая структура, показывающая ход сахаро-фосфатного остова и расположение оснований. Атомы водорода не показаны. Атомы фосфора выделены сферами.

В меньший (малый или минорный) желобок выходят гликозидные связи. Этот желобок относительно беден функциональными группами. В него выходят О2 пиримидиновых оснований N3 пуриновых оснований

А-Форма ДНК (РНК)

А-Форма была открыта почти одновременно с уотсон-криковской В-формой, однако ее интенсивные исследования начались существенно позже. А-Форма является основной структурой двуспиральных участков РНК. А-ДНК вне клетки существует либо в волокнах при пониженной относительной влажности, либо в водно-спиртовых растворах при содержании спирта выше 70%. Биологическая роль А‑ДНК окончательно не установлена. Предполагается, что она образуется при взаимодействии В-ДНК с некоторыми белками и участвует в регуляторных процессах.

Как и В-ДНК, А-форма представляет собой правую спираль, все основания которой находятся в анти-конформации (Рис. 3 .16). Принципиальным отличием А-ДНК является конформация сахарного остатка. В отличие от В-формы, все сахара А-ДНК находятся в С3-эндо-конформации. Именно это основное структурное отличие является причиной остальных особенностей строения А-формы.

Рис. 3.15. А-Форма ДНК. На нижней проекции видно, что пары оснований наклонены к оси спирали. Поскольку пары оснований отодвинуты от оси спирали, внутри спирали образуется полый цилиндр.

Поскольку расстояние между 3- и 5‑фосфатами в нуклеозидах с С3-эндо-конформацией фуранозы заметно меньше, чем в нуклеозидах с С2-эндо-конформацией (5,9 против 7,0 Å) угол спирального закручивания А-формы меньше, чем В‑структуры (30° у А-РНК и 33° у А-ДНК в сравнении с 36° у В-ДНК). Соответственно увеличивается число пар на виток спирали до 12 у А‑РНК и 11 у А-ДНК. Пары оснований отодвинуты от оси спирали (D  4,5 Å). Это приводит к образованию вдоль оси спирали полого цилиндра с ван-дер-ваальсовым радиусом ~3,5 Å (хорошо виден на Рис. 3 .16 на проекции вдоль оси спирали).

Рис. 3.16. А-Форма ДНК. На нижней проекции видно, что пары оснований наклонены к оси спирали. Поскольку пары оснований отодвинуты от оси спирали, внутри спирали образуется полый цилиндр, хорошо видный на верхней проекции.

Поскольку пары оснований сильно наклонены к оси спирали ( 20°), при сохранении оптимального для стекинг-взаимодействия расстояния между плоскостями оснований (3,4 Å) проекция пары на ось спирали уменьшается до ~2.7 Å.

Таким образом, А-ДНК «толще» и «короче» В-формы. Длина фрагмента А-ДНК из 10 пар оснований равна лишь ~27 Å

При сравнении В- (Рис. 3 .14) и А-ДНК (Рис. 3 .16) хорошо видно различие в строении желобков. Главный желобок в А-форме уже и существенно глубже, чем в В-форме. И, наоборот, малый желобок шире и мельче.

А- и В-формы могут переходить одна в другую. При уменьшении относительной влажности в волокнах ДНК или при увеличении содержания спирта в растворе В-ДНК превращается в А-форму. Этот переход кооперативен и полностью обратим.

Z-Форма ДНК

Z-ДНК принципиально отличается от рассмотренных выше структур. Это единственная известная левая спираль. Она была постулирована в 1972 г. Полом и Джовином. Изучая синтетический полинуклеотид с (dG–dC)_n-последовательностью в растворе, они наблюдали при увеличении концентрации NaCl до 2,5 М превращение В‑формы в некую новую структуру, которой на основании обращенного спектра кругового дихроизма приписали левоспиральное строение. Окончательно существование левой спирали было доказано методом рентгеноструктурного анализа (Рис. 3 .17). Несмотря на столь вопиющее отличие от В- и А-форм, Z-форма относится к каноническим структурам, поскольку цепи в ней ориентированы антипараллельно, а основания связаны уотсон-криковскими водородными связями. Z-Форма наблюдается только для полинуклеотидов с чередующейся гуанин-пиримидиновой последовательностью при высокой концентрации солей. Ее биологическая функция до сих пор не установлена.

Рис. 3.17. Z-Форма ДНК. Пары оснований перпендикулярны оси спирали, а угол спирального вращения варьирует через один стекинг-контакт от 0 до 60°, что приводит к зигзагообразному ходу сахарофосфатного остова.

Левоспиральность не единственное существенное отличие Z‑формы от А и В. Если А- и В-ДНК являются регулярными полинуклеотидами (единица повторяемости — мононуклеотид), то Z‑форма — бирегулярна (единица повторяемости — динуклеотид). Причем конформация нуклеозидов в этом динуклеотиде существенно различна. Пуриновый нуклеозид (как правило гуанозин) имеет С2-эндо-конформацию углеводного цикла и син-конформацию нуклеинового основания. В то же время пиримидиновый нуклеозид (цитидин) — С3-эндо-конформацию сахара и анти‑конформацию нуклеинового основания. Точно так же варьирует и угол спирального вращения. Если для CpG‑контакта  близок 0°, то для GpC-контакта — к 60°. Это приводит к зигзагообразному ходу сахаро-фосфатного остова (Рис. 3 .17). Именно из-за этой особенности строения структуру назвали Z-формой.

Пары оснований почти перпендикулярны оси спирали. Расстояние между парами (а, значит, и проекция пары на ось спирали) несколько больше оптимального расстояния стекинг-взаимодействия и равно ~3,7 Å. Таким из всех канонических структур Z-форма самая «длинная». Длина фрагмента из 10 пар оснований ~37 Å. У Z‑формы только один малый желобок, область большого желобка заполнена атомами С5 цитозина и N7 и С8 гуанина.

Полиморфизм ДНК

Рис. 3.18. А-Форма ДНК. На нижней проекции видно, что пары оснований наклонены к оси спирали. Поскольку пары оснований отодвинуты от оси спирали, внутри спирали образуется полый цилиндр, хорошо видный на верхней проекции.

Приведенные выше структуры представляют собой идеализированные модели, в которых конформация всех мономеров одинакова и соответствует усредненной геометрии нуклеозидов в структуре. В реальных ДНК и конформация мономерных единиц, и параметры спирали заметно зависят от нуклеотидной последовательности. В настоящее время накоплен большой экспериментальный материал по рентгено-структурному анализу коротких олигонуклеотидов с разрешением на атомном уровне. Эти данные позволяют судить о возможных пределах вариации конформационных параметров.

Оказалось, что наиболее вариабельной (конформационно «мягкой») структурой является В‑ДНК. Существенно большей конформационной «жесткостью» обладает А-ДНК, а Z‑форма наиболее структурно консервативна.

Угол спирального вращения в В-форме ДНК может изменяться от 32 до 41° (соответственно, число пар на оборот спирали — от ~9 до ~11), а проекция пары на ось спирали — от 3,2 до 3,6 Å. Интересной особенностью является «скручивание» оснований в паре, делающее пару оснований похожей на пропеллер. Угол такого «скручивания» меняется от 5 до 17° (среднее значение ~10°). Существенно варьирует вдоль цепи и конформация фуранозного цикла. Оставаясь в пределах одного S-семейства, конформация сахара может изменяться от С1-экзо до О4-эндо.

Тем не менее, усредненные конформационные параметры всех изученных до настоящего времени олигонуклеотидов весьма близки к параметрам идеализированной В-ДНК.