1.2.4.Третичная структура биополимеров

Третичная структура белков

Третичная структура белка — это полная трехмерная структура одной неделимой структурной единицы. В случае белков такой единицей является обычно частица, все атомы которой связаны ковалентными связями (включая S–S-мостики). Как уже говорилось выше, структура биополимеров теснейшим образом связана с их биологической функцией. Для того, чтобы выполнять «строительные» функции (волосяной покров, укрепление стенок клетки, цитоскелет клетки и т.п.) белок должен обладать вытянутой линейной структурой и не растворяться в воде. Такие белки называются фибриллярными.

Структура фибриллярных белков

Что бы обладать вытянутой нитевидной структурой, белок должен быть высоко структурирован, т.е. обладать вторичной структурой (-спиральной или -складчатой) на большом протяжении. Кроме того, в первичной структуре должны преобладать неполярные аминокислоты. Высокая степень структурированности фибриллярных белков не позволяет им сворачиваться в компактные структуры (глобулы) и гидрофобные радикалы аминокислотных остатков экспонированы в воду, что обеспечивает нерастворимость в воде.

Наиболее распространенными структурными мотивами фибриллярных белков являются навитые одна на другую ‑спирали (суперспираль) (Рис. 3 .19А) или антипараллельные -слои (Рис. 3 .10). Особняком стоит тройная спираль коллагена — основного белка соединительной ткани (Рис. 3 .19Б).

Рис. 3.19. Примеры фибриллярных структур. А — фибриллярный «хвост» миозина (белка, участвующего в мышечном сокращении); Б — тройная спираль коллагена.

Полипептидные цепи коллагена построены из чередующихся блоков Gly–X–Pro или Gly–X–Hyp (Hyp — оксипролин). Как пролин, так и оксипролин препятствуют образованию ‑спиралей и -складок. Тройная спираль коллагена принципиально отличается от ‑спирали. Это очень слабо закрученная (один оборот на 1000 Å) левая спираль.

Структура глобулярных белков

Кроме структурных функций белки выполняют разнообразные функции. Среди них одна из главных — катализ химических реакций, протекающих в клетке. Для осуществления каталитической (ферментативной) функции белок должен связываться с трехмерным субстратом, т.е. место связывания, называемое активным центром, должно быть трехмерным. А это возможно только при условии, что сам белок имеет трехмерную третичную (глобулярную) структуру. Таким образом, соответствие структуры и функции, предопределяет наличие у функциональных белков глобулярной структуры. Кроме того, глобулярная структура обеспечивает растворимость белков в воде (большинство реакций протекает в цитоплазме клетки). Действительно, гидрофобные радикалы аминокислотных остатков могут быть спрятаны внутрь глобулы, а в воду экспонированы гидрофильные остатки.

Для обеспечения компактной трехмерной структуры белок должен обладать элементами вторичной структуры небольшой протяженности, соединенных неструктурированными участками полипептидной цепи. Эти участки позволяют белку сворачиваться в компактную глобулу.

Рис. 3.20. Первичная последовательность гормона инсулина. Показаны S–S-мостики и участки первичной последовательности, образующие вторичные структуры.

Рис. 3.21. Третичная структура инсулина. Короткая цепь выделена более светлой. Здесь и далее спиралями представлены -спиральные участки, стрелками — -складки и цилиндрическими кривыми — нерегулярные участки. Пунктиром показаны водородные связи, а сплошными линиями — S–S‑мостики.

Рассмотрим особенности строения глобулярных белков на примере одного из самых простых белков — инсулина. Гормон состоит из двух пептидных цепей — короткой (21 аминокислотный остаток) и длинной (30 аминокислотных остатка). Первичная последовательность инсулина приведена на Рис. 3 .20, а третичная структура — на Рис. 3 .21.

На Рис. 3 .21 хорошо видно, что три S–S-мостика играют ключевую роль в организации третичной структуры. Один из них взаимно ориентирует две -спирали короткой последовательности, а два других скрепляют короткую и длинную цепи. Кроме того, третичная последовательность буквально пронизана водородными связями.

Рис. 3.22. Третичная структура миозина (показана лишь часть фибриллярной структуры).

Третичная структура инсулина состоит в основном из -спиралей. Структура рибонуклеазы А (одна цепь, 128 аминокислотных остатков) построена преимущественно из -слоев (Рис. 3 .23). Тем не менее, основные принципы организации остаются прежними. S–S-Мостики (4 мостика) вкупе с большим числом водородных связей (72 связи) служат каркасом молекулы и скрепляют структуру в плотную глобулу.

Рис. 3.23. Третичная структура рибонуклеазы А.

Рис. 3.24. Третичная структура миглобина кашалота.

Гем-содержащий белок — миоглобин кашалота построен только из -спиралей, между которыми за счет ван-дер-ваальсовых и гидрофобных взаимодействий закреплен железосодержащий гем (Рис. 3 .24).

В заключение, что бы показать однозначное соответствие между структурой и функцией, рассмотрим третичную структуру миозина. Этот белок выполняет сократительную функцию, реализуемую за счет скольжения цепей одна относительно другой и ферментативную функцию, обеспечивающую это движение энергией. Для выполнения первой функции необходима фибриллярная, а для выполнения второй — глобулярная структура. Как видно из Рис. 3 .22 в соответствие со своей функцией белок имеет гибридную, фибриллярно-глобулярную третичную структуру.

Третичная структура нуклеиновых кислот

Основная функция ДНК — хранение и передача генетической информации. Безошибочное считывание информации (транскрипция) возможно лишь при условии, что информация расположена линейно (как в строках текста) и на пути считывающего устройства (в данном случае матричного фермента, ДНК-зависимой РНК-полимеразы) не будет встречаться непреодолимых препятствий (резких изгибов и слипания отдельных участков). В соответствии с биологической функцией ДНК полностью структурирована (двойная спираль, В-форма). Таким образом, у ДНК практически отсутствует третичная структура.

Одноцепочечная матричная РНК (мРНК) служит для переноса генетической информации на сложный белково-нуклеиновый комплекс, рибосому, где информация, записанная нуклеотидными остатками, переводится на язык аминокислотных остатков (матричный синтез белков, трансляция).

C точки зрения биологической функции желательно, что бы мРНК имела нитевидную структуру. Однако это невозможно по термодинамическим. Образование двойной спирали энергетически выгодно при физиологических температурах (~37°С). Если в нуклеотидной последовательности мРНК встречаются частично комплементарные участки, они образую шпильки с двуспиральным стеблем и односпиральной петлей. Такие шпильки могут помешать нормальному считыванию генетической информации с мРНК. Поэтому в процессе эволюции были выработаны механизмы, позволяющие рибосоме разворачивать шпилечные третичные структуры в момент прохождения мРНК через участок считывания информации.

Единственной нуклеиновой кислотой, обладающей функционально-значимой третичной структурой, являются транспортные РНК (тРНК). тРНК переносит аминокислотный остаток на рибосому, где он встраивается в синтезируемую цепь белка. Для каждой аминокислоты существует отдельная, специфичная только для нее тРНК. Аминокислотный остаток присоединяется к своей тРНК ферментом, аминоацил-тРНК–синтетазой. Для каждой аминокислоты существует своя синтетаза, которая «узнает» нужную тРНК и присоединяет к ней «правильный» аминокислотный остаток. Таким образом, взаимодействие тРНК с синтетазой является специфическим. Затем тРНК с присоединенным аминокислотным остатком (аминоацил-тРНК) связывается с рибосомой в А-участке (подробнее синтез белка на рибосоме рассмотрен в ). Это место связывания универсально для всех аминоацил-тРНК, т.е. связывание в нем неспецифично. Присоединение к растущей белковой цепи нужного аминокислотного остатка обеспечивается комплементарностью трех нуклеотидов мРНК (кодон) трем нуклеотидам тРНК (антикодон). Таким образом, чтобы соответствовать функции третичная структура тРНК должна обеспечивать, во-первых, одинаковое взаимное расположение антикодона и акцепторной ветви во всех тРНК и, во-вторых, специфическое взаимодействие с аминоацил-тРНК–синтетазой и неспецифическое взаимодействие с А-участком рибосомы.

Первая модель тРНК была предложена исходя из первичной структуры на основе принципа максимального спаривания оснований. Эта модель получила название «клеверный лист» (Рис. 3 .25). Оказалось, что все тРНК обладают рядом общих структурных особенностей. В частности, у них одинаковое число спаренных оснований в акцепторной и антикодоновой ветвях и у всех семь нуклеотидов в антикодоновой петле. Эта особенность определяет одинаковое взаимное расположение присоединенного к 3‑концу аминокислотного остатка и антикодона.

Рис. 3.25. «Клеверный лист» — обобщенная вторичная структура, характерная для всех тРНК. Кружками обозначены нуклеотидные остатки, пунктиром — водородные связи между комплементарными основаниями. Обозначения: Pur — пуриновый нуклеозид, Pyr — пиримидиновый нуклеозид,  — псевдоуридин, G* — гуанозин или 2-О-метилгуанозин, Т — риботимидин.

Третичная структура тРНК была установлена методом рентгеноструктурного анализа (Рис. 3 .26). Оказалось, что в третичной структуре «клеверный лист» как бы сложен пополам по диагонали между ветвями, образуя несимметричную структуру, напоминающую букву Г. Вероятно, это связано с тем, что специфическое связывание с аминоацил-тРНК–синтетазой и неспецифическое связывание с рибосомой осуществляется разными сторонами структуры и несимметричность облегчает распознавание сторон пространственной структуры.

Рис. 3.26. Третичная структура дрожжевой фенилаланиновой тРНК. Показан ход сахаро-фосфатного остова. Шариками отмечены атомы фосфора. Отрезки, соединяющие атомы фосфора, указывают на образование комлементарных пар соответствующими остатками.

Четвертичная структура белков

В клетке достаточно часто встречаются белки, состоящие не из одной, а из нескольких структурных единиц. Такие белки называются олигомерными. Отдельные структурные единицы олигомерного белка называют субъединицами. Олигомерный белок может содержать две, три, четыре или более субъединиц. Иногда встречаются олигомеры, состоящие из 12 субъединиц и имеющие молекулярную массу до 1 000 000. Субъединицы могут быть одинаковыми или разными Взаимное расположение субъединиц, т.е. способ их совместной укладки и упаковки с образованием нативной конформации олигомерного белка и называют четвертичной структурой.

Наиболее изученным олигомерным белком является человеческий гемоглобин, который состоит из четырех субъединиц, двух  (по 141 остатку в каждой) и двух (по 146 остатков в каждой) (Рис. 3 .27). Субъединицы уложены приблизительно в виде тетраэдра, с каждой субъединицей связана одна молекула гема. Третичная структура каждой субъединицы гемоглобина имеет много общего с третичной структурой миглобина (Рис. 3 .24). Такое сходство связано с тем, что обе молекулы выполняют сходную функцию, связывание и транспорт кислорода.

1.2.5.

Рис. 3.27. Пространственная структура человеческого гемоглобина по данным рентгеноструктурного анализа. Более темным цветом выделены ‑субъединицы.

Самоорганизация пространственной структуры биополимеров

Как было сказано выше в Разделе «Силы, стабилизирующие пространственную структуру биополимеров» (стр. 10), число возможных конформеров даже для относительно небольших биополимеров невообразимо велико. Однако экспериментальные исследования показывают, что биополимеры существуют либо в виде одной функционально активной структуры (нативной структуры), либо в виде равновесной смеси очень небольшого числа (как правило, двух) конформеров. Для того, чтобы биополимер принял нативную структуру необходимо, чтобы эта структура была запрограммирована в самой первичной последовательности биополимера. Случайное образование даже термодинамически наиболее выгодной (наиболее стабильной) структуры чрезвычайно маловероятно. Действительно, при случайном переборе по всем двугранным углам на это потребовалось бы ~10⁵⁰ лет. В клетке же синтез и складывание в нативную структуру белка из 100 аминокислотных остатков занимает около 5 сек. Таким образом, должны существовать более быстрые пути сворачивания полипептидной цепи в нативную структуру.

Самоорганизация белковых молекул начинается с формирования в благоприятных участках небольших фрагментов -спиралей и -складок. Этот процесс может протекать очень быстро, поскольку происходит на ограниченном участке пептидной цепи. К тому же образование «зародышей» вторичной структуры может протекать независимо сразу в нескольких участках полипептидной цепи. Фактически образование таких зародышей является скорость лимитирующей стадией, существенно облегчающей структурирование примыкающих участков. Такое явление, когда образование зародышевого фрагмента структуры облегчает дальнейшее сворачивание, называется кооперативностью.

Образования фрагментов вторичной структуры существенно облегчает образование третичной структуры белка. Теперь для этого требуется не независимое и случайное перемещение всех звеньев молекулы, а только перемещение этих фрагментов как единого целого. Установление контакта между двумя фрагментами вторичной структуры ограничивает степени свободы движения остальных фрагментов и тем самым облегчает установление следующего контакта и т.д. Таким образом, и образование третичной структуры является высоко кооперативным процессом.

В случае очень больших белков для облегчения складывания в третичную структуру в процессе эволюции выработался промежуточный уровень структурной организации. Глобула всего белка состоит из отдельных глобул, так называемых кластеров, с законченной третичной структурой. Очевидно, что структурная организация каждого домена происходит независимо от остальных, а складывание доменов в конечную структуру является кооперативным процессом.

Для функционирования биологических систем процессы организации двойной спирали ДНК, по-видимому, большого значения не имеют, поскольку в клетке дуплексы образуются главным образом при синтезе комплементарной нити на однонитевой ДНК или РНК.

Образование высокоорганизованной молекулы биополимера сопровождается уменьшением энтропии. Поэтому при повышении температуры неизбежно наступает момент, когда нативная структура становится неустойчивой.

В случае белков происходит разрушение третичной и вторичной структуры и биополимер превращается статистический клубок. Такой процесс называют денатурацией. Кроме термической денатурации возможна «химическая» денатурация, заключающаяся в воздействии на биополимер денатурирующих агентов. Наиболее распространенными денатурирующими агентами являются мочевина (используют насыщенный раствор) и формамид. Денатурированный белок полностью теряет свою биологическую активность.

Рис. 3.28. Типичная кривая плавления полинуклеотида

Тепловая денатурация двуспиральных нуклеиновых кислот происходит в узком интервале температур и в значительной мере напоминает фазовый переход. Поэтому для этого процесса чаще используют термин «плавление» (Рис. 3 .28). Температуру, соответствующую плавлению половины дуплексов называют температурой плавления (Т_пл). В случае полинуклеотидов Т_пл может служить мерой стабильности двуспиральной структуры. Температура плавления повышается при увеличении длины комлементарных последовательностей и при увеличении относительного содержания GC-пар.

Стекинг-взаимодействие оснований в двуспиральной структуре сопровождается уменьшением коэффициента экстинкции гетероциклических оснований. Такое понижение поглощения, называемое «гипохромным эффектом», может достигать 40%. Поэтому плавление дуплексов сопровождается увеличением поглощения (измерения проводят, как правило, в области максимума поглощения нуклеозидов при 260 нм), что позволяет измерять кривые плавления непосредственно в кювете спектрофотометра (Рис. 3 .28).

Плавление представляет собой кооперативный процесс. Это связано с тем, что каждой пары сопровождается существенным ростом энтальпии, который может скомпенсировать разупорядочивание достаточно длинного участка последовательности.

Процесс обратный денатурации биополимера называется ренатурацией. Ренатурация белка возможна лишь в том случае, если его структура полностью закодирована в первичной последовательности.

Классический эксперимент по ренатурации белка провел в 50-х годах Кристиан Анфинсен на примере рибонуклеазы А, одноцепочечного белка с четырьмя S–S-мостиками (Рис. 3 .23). При действии насыщенного раствора мочевины в присутствии восстановителя полипептидная цепь полностью разворачивается с разрывом всех S–S-мостиков и фермент утрачивает каталитическую активность. Если поместить денатурированный белок в диализный мешочек и погрузить этот мешочек в воду, то низкомолекулярные соединения (мочевина и восстановитель) будут диффундировать в воду (размер пор у диализного мешочка таковы, что через них могут проникать небольшие молекулы, но не молекулы белка). По мере понижения концентрации мочевины и восстановителя рибонуклеаза начинает сворачиваться, а цистеины окисляться растворенным в воде кислородом воздуха с образованием S–S-мостиков. Оказалось, что в результате диализа рибонуклеаза возвращается к нативному состоянию с полным восстановлением каталитической активности. Особенно замечательным является тот факт, что в результате ренатурации из 105 различных вариантов S–S-мостиков, которые может дать случайная комбинация 8 остатков цистеинов, реализуется только один нативный вариант.

Таким образом, аминокислотная последовательность полипептидной цепи содержит всю информацию, необходимую для того, чтобы цепь свернулась в нативную трехмерную структуру.

Этому очень важному выводу казалось бы противоречат эксперименты по ренатурации инсулина, коротенького белка состоящего из двух цепей (20 и 31 аминокислотный остаток) и содержащего 3 S–S-мостика (Рис. 3 .21). После ренатурации инсулин образует сложную смесь продуктов с различными комбинациями дисульфидных сшивок (всего таких комбинаций возможно 15). Однако дальнейшие исследования показали, что в клетке синтезируются не А‑и В-цепи инсулина, а одноцепочечный белок проинсулин. Этот белок состоит из С‑фрагмента (34 аминокислотных остатка), по краям которого присоединены А- и В‑последовательности инсулина. Проинсулин однозначно складывается в нативную структуру с одним нативным набором S–S-мостиков. После того, как нативная структура образовалась, специальный фермент «вырезает» С-фрагмент, превращая проинсулин в две соединенные между собой цепи инсулина.

Образования дуплексов из отдельных комлементарных цепей полинуклеотидов называют ренатурацией (воссоединение предварительно разделенных цепей) или гибридизацией (образование дуплекса из одноцепочечной нуклеиновой кислоты и добавленной извне комплементарной цепью или фрагментом такой цепи). Гибридизация нуклеиновых кислот широко используется в фундаментальных и прикладных биохимических и молекулярно биологических исследованиях.

Взаимодействие полинуклеотидных цепей начинается со встречи их фрагментов и образования зародышей двойной спирали (две–три пары). Образование таких зародышей сближает соседние звенья, а конформация границы спираль-две цепи благоприятствует дальнейшему распространению спирали, поэтому дальнейшее замыкание спирали протекает с нарастающей скоростью наподобие застегиванию застежки «молния».

В заключение следует отметить, что сборка многокомпонентных надмолекулярных структур, несмотря на заложенную в их компоненты способность к взаимному узнаванию, не является полностью самопроизвольным процессом. Как правило, в образовании сложных многосубъединичных белков или нуклеопротеидов участвуют вспомогательные белки, отсутствующие в конечной структуре. Такие специальные белки называются шаперонами или белками теплового шока (они особенно интенсивно синтезируются при повышении температуры).

54