Дополнительный материал в помощь студенту.

ЭКСПРЕССНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ (быстрое обнаружение возбудителя вирусной инфекции без выделения чистой культуры)

1. Выявление клеток (частиц) возбудителя в исследуемом материале:

• Люминисцентно - серологический метод (реакция иммунофлюоресценции – прямой и непрямой методы Кунса);

• электронная микроскопия (при концентрации не менее 10 ⁶ клеток в 1 мл можно обнаружить возбудителей бактериальных и вирусных инфекций) – ответ через 1 час;

• иммунная электронная микроскопия (иммунные комплексы в микроскопе видны как агрегаты или венчик из антител на поверхности клеток, вирусных частиц) – ответ через 2-3 часа (минимальная концентрация – 10⁴ частиц в 1 мл);

2. Выявление нуклеиновых кислот возбудителя (специфических нуклеотидных последовательностей):

• ДНК-зондирование (молекулярная гибридизация)

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – введение праймера в исследуемый материал, наработка и идентификация специфических для возбудителя генопродуктов.

Частная вирусология

Тема лабораторной работы №15:

ВОЗБУДИТЕЛИ РЕСПИРАТОРНЫХ, КОНТАКТНЫХ, КИШЕЧНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ.

ЦЕЛИ: знать основные свойства возбудителей гриппа, кори, полиомиелита, бешенства; уметь обосновать выбор метода обнаружения вирусов в клиническом материале; иммунобиологических препаратов для лечения и профилактики указанных инфекций.

План и расчет времени занятия

1. Вступительное слово преподавателя (техника безопасности при работе в микробиологической лаборатории) – 5 мин.

2. Контроль теоретической подготовки студентов - 10 мин.

3. Задание по выполнению лабораторной работы - 10 мин.

4. Самостоятельная работа студентов под руководством преподавателя, оформление протоколов - 70 мин.

5. Заключительное слово преподавателя, задание на экспериментальную работу по следующей теме - 5 мин.

ИТОГО: «100» мин

Материально-техническое оснащение

1. Инструменты и оборудование:

Микроскопы, микропрепараты (зараженные и незараженные культуры клеток, вирусные включения), среда 199, среда Игла, планшеты, пробирки, наборы иммунобиологических препаратов. Расходный материал - иммерсионное масло, вазелиновое масло, среда 199, эритроцитарная масса, гриппозные и полиомиелитные диагностикумы, физиологический раствор, карандаш по стеклу.

2. Стенды: «Рейтинговая оценка знаний студентов», «Вирусы»

3. Таблицы: «Морфология вирусов», «Включения при бешенстве», «Цитопатическое действие вирусов», «Формы взаимодействия вирусов с чувствительной клеткой».

Контрольные вопросы.

1. Дайте характеристику основных свойств возбудителей гриппа, кори, полиомиелита, бешенства (принадлежность к семейству, тип нуклеиновой кислоты, особенности формы и строения вирусной частицы, наличие гемагглютинирующей активности и цитопатического действия, методы культивирования).

2. Что служит основой для выявления типов вируса гриппа: А, В, С? На основание каких антигенов вирусы гриппа типа А классифицируют на подтипы (штаммы)?

3. Перечислите источники инфекции при гриппе, полиомиелите, бешенстве. Как происходит заражение указанными инфекциями?

4. Какие известны разновидности вируса бешенства? Чем они отличаются?

5. Назовите особенности иммунитета при гриппе.

6. Как обнаруживают вирусы гриппа, полиомиелита, бешенства в исследуемом материале?

ВЫПОЛНЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ

(время - 70 мин)

1. Изучить материал учебных таблиц, стендов

2. Изучить морфологию культур клеток, цитопатическое действие вирусов, включения при вирусных инфекциях по демонстрационным таблицам и микропрепаратам.

3. Изучить методы выявления антител при вирусных инфекциях

4. Познакомиться с набором экзаменационных препаратов

5. Оформить отчет о работе.

ПРАВИЛА ОФОРМЛЕНИЯ ОТЧЕТА.

1. Ответить письменно на контрольные вопросы.

2. Учесть реакцию нейтрализации при полиомиелите, сделать вывод о титрах антител в реакции

3. Учесть реакцию торможения гемагглютинации при гриппе, сделать вывод о титрах антител в реакции

4. Записать характеристику по 2 экзаменационным препаратам.

Дополнительный материал в помощь студенту.

Препараты, применяемые для профилактики БЕШЕНСТВА

   

«Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая» (КОКАВ) (Россия)

СОСТАВ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА. Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая (КОКАВ) представляет собой вакцинный вирус бешенства штамм Внуково-32, 30-го - 38-го пассажа, выращенный на первичной культуре клеток почек сирийских хомяков, концентрированный и очищенный методами ультрафильтрации, или ультрацентрифугирования, или ионообменной хроматографии, инактивированный ультрафиолетовыми лучами. Одна доза (1,0 мл) содержит не менее 2,5 Международных Единиц (ME). Вакцина индуцирует выработку иммунитета против бешенства.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ И ДОЗИРОВКА. Растворенную вакцину вводят медленно внутримышечно в дельтовидную мышцу плеча, детям до 5 лет - в верхнюю часть переднебоковой поверхности бедра. Введение вакцины в ягодичную область не допускается. ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ИММУНИЗАЦИЯ. Показания. Контакт и укусы людей бешеными, подозрительными на бешенство или неизвестными животными. Противопоказания - отсутствуют. Схема лечебно - профилактической иммунизации. Подробная схема лечебно - профилактической иммунизации и примечания к схеме представлены в конце инструкции. Если, согласно данной инструкции, будет проводиться комбинированное лечение антирабическим иммуноглобулином (АИГ) и антирабической вакциной (КОКАВ), то оба препарата вводятся одновременно (сначала вводится АИГ, затем КОКАВ; в разные места). Антирабический иммуноглобулин (АИГ) назначают как можно раньше после контакта с бешеным, подозрительным на бешенство или неизвестным животным, но не позднее 3 суток после контакта. АИГ не применяется после введения антирабической вакцины (КОКАВ). Доза антирабического иммуноглобулина (АИГ). Гетерологичный (лошадиный) антирабический иммуноглобулин назначается в дозе 40 ME на 1 кг массы тела. Гомологичный (человеческий) антирабический иммуноглобулин назначается в дозе 20 ME на 1 кг массы тела. Как можно большая часть рассчитанной дозы АИГ должна быть инфильтрирована в ткани вокруг ран и в глубине ран. Если анатомическое расположение повреждения (кончики пальцев и др.) не позволяет ввести всю дозу АИГ в ткани вокруг ран, то остаток АИГ вводят внутримышечно (мышцы ягодицы, верхняя часть бедра, плеча). Локализация введения иммуноглобулина должна отличаться от места введения вакцины. Перед введением гетерологичного антирабического иммуноглобулина необходимо проверить индивидуальную чувствительность пациента к лошадиному белку. ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ИММУНИЗАЦИЯ. Показания. С профилактической целью иммунизируют лиц, выполняющих работы по отлову и содержанию безнадзорных животных; ветеринаров, охотников, лесников, работников боен, таксидермистов; лиц, работающих с «уличным» вирусом бешенства. Схема профилактической иммунизации

Первичная иммунизация	Три инъекции в 0, 7 и 30 день по 1,0 мл
Первая ревакцинация через 1 год	Одна инъекция, 1,0 мл
Последующие ревакцинации через каждые 3 года	Одна инъекция, 1,0 мл

СХЕМА ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРИВИВОК КОКАВ И АНТИРАБИЧЕСКИМ ИММУНОГЛОБУЛИНОМ (АИГ)

Категория повреждения	Характер контакта *	Данные о животном	Лечение
1.	Нет повреждений и ослюнения кожных покровов. Нет прямого контакта	Больное бешенством	Не назначается
2.	Ослюнения неповрежденных кожных покровов, ссадины, одиночные поверхностные укусы или царапины тулови­ща, верхних и нижних конечностей (кроме головы, лица, шеи, кисти, пальцев рук и ног, гениталий), нанесенные домашними и сельскохозяйст­венными животными	Если в течение 10 суток наблюдения за животным ' оно остается здоровым, то лечение прекращают (т. е. после 3- ей инъек­ции). Во всех других слу­чаях, когда невозможно наблюдение за животным (убито, погибло, убежало, исчезло и пр.), лечение продолжить по указанной схеме	Начать лечение немедленно: КОКАВ по 1,0 мл в 0, 3, 7, 14, 30 и 90 день
3.	Любые ослюнения слизистых оболочек, любые укусы головы, лица, шеи, кисти, пальцев рук и ног, гени­талий; множественные укусы и глубокие одиночные укусы любой локализации, нанесен­ные домашними и сельскохо­зяйственными животными. Любые ослюнения и повреж­дения, нанесенные дикими плотоядными животными, летучими мышами и грызунами	В случаях, когда имеется возможность наблюдения за животным, и оно в те­чение 10 суток остается здоровым, лечение пре­кращают (т. е. после 3- ей инъекции). Во всех остальных случаях, когда невозможно наблюдение за животным, лечение продолжить по указанной схеме	Начать комбинированное лечение немедленно и одновременно: АИГ в 0 день + КОКАВ по 1,0 мл в 0, 3, 7, 14, 30 и 90 день

* Под контактом подразумеваются укушенные раны, царапины, ссадины и места ослюнения.

ПРИМЕЧАНИЯ. Дозы и схемы иммунизации одинаковы для детей и взрослых. Курс лечения вакциной назначают независимо от срока обращения пострадавшего за помощью, даже через несколько месяцев после контакта с больным, подозрительным на бешенство или неизвестным животным (кроме АИГ). Для лиц, получивших ранее полный курс лечебно-профилактических или профилактических прививок, с окончания которого прошло не более 1 года, назначают три инъекции вакцины по 1,0 мл в 0, 3 и 7 день; если прошел год и более/был проведен неполный курс иммунизации - то в соответствии с приведенной «Схемой лечебно-профилактических прививок КОКАВ и антирабическим иммуноглобулином (АИГ)».

«Вакцина антирабическая культуральная инактивированная сухая для иммунизации человека (рабивак-внуково-32 » (Россия)

СОСТАВ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА. Обеспечивает формирование иммунитета к возбудителю бешенства. Применяют для лечебно-профилактической или профилактической иммунизаций человека против бешенства. Инактивированная вакцина для профилактики бешенства (штамм Внуково-32, выращенный в первичной культуре клеток почек сирийских хомяков), иммуногенная активность не менее 0,5 МЕ/мл. СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ И ДОЗИРОВКА – см. «Вакцина КОКАВ»

«Вакцина Рабипур» (Гермаия)

СОСТАВ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА. 1 доза лиофилизированного порошка содержит инактивированный вирус бешенства (штамм Flury LEP) с активностью более 2,5 МЕ. Рабипур получают путем выращивания штамма вируса Flury LEP на культуре куриных фибробластов. Создает специфический иммунитет против бешенства.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ И ДОЗИРОВКА В/м (в дельтовидную мышцу, у детей раннего возраста — в переднелатеральную область бедра, но не в ягодицу). Для профилактики бешенства (предэкспозиционная вакцинация): проводится на 0, 7, 21 (или 28) дни, затем через 1 год. Для экстренной (постэкспозиционной) вакцинации. Невакцинированным против бешенства или получившим неполную вакцинацию вводят по 1 дозе в 0, 3, 7, 14, 30 и 90 дни. Иммунизированным ранее против бешенства — 1-3 вакцинации на 0, 3 и 7 дни в зависимости от тяжести повреждений и срока предэкспозиционной вакцинации. При значительных повреждениях (высокая вероятность заражения) проводится комбинированная профилактика (с человеческим антирабическим иммуноглобулином). Нельзя вводить в/в.

«Иммуноглобулин антирабический из сыворотки лошади, жидкий» (Россия)

СОСТАВ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА. Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади жидкий (АИГ) является белковой фракцией иммунной сыворотки крови лошади, полученной риванол-спиртовым методом. Титр специфических антител — не менее 150 МЕ/мл. Стабилизатор — гликокол. Иммуноглобулин антирабический создает пассивный антивирусный иммунитет и имеет способность нейтрализовать вирус бешенства как in vitro, так и in vivo.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ И ДОЗИРОВКА. Немедленно или как можно скорее после укуса или повреждения осуществляют местную обработку раны. Раны тщательно промывают мыльной водой (или детергентом) и обрабатывают 40-70-градусным спиртом или настойкой йода. После местной обработки раны срочно начинают специфическое лечение. Наиболее эффективно введение иммуноглобулина в первые сутки после травмы. Антирабический иммуноглобулин вводят в дозе 40 ME на 1 кг массы тела взрослого или ребёнка. Пример: масса тела пациента — 60 кг, активность иммуноглобулина (указанная на этикетке пачки), например, 200 ME в 1 мл. Для того, чтобы определить необходимую для введения дозу иммуноглобулина, необходимо вес пациента (60 кг) умножить на 40 ME и разделить полученное число на активность препарата (200 ME), то есть: 60х40/200=12 мл. Перед введением пациенту антирабического иммуноглобулина для определения чувствительности к чужеродному белку в обязательном порядке выполняют внутрикожную пробу с разведённым 1:100 иммуноглобулином (ампулы, маркированные красным цветом), который находится в пачке с неразведённым препаратом (ампулы, маркированные синим цветом). Разведённый 1:100 иммуноглобулин в дозе 0,1 мл вводят внутрикожно в сгибательную поверхность предплечья. Проба считается отрицательной, если через 20-30 минут отёк или покраснение в месте введения менее 1 см. Проба считается положительной, если через 20 минут отёк или покраснение в месте введения достигают 1 см и более. Если реакция отрицательная, в подкожную клетчатку плеча вводят 0,7 мл разведённого 1:100 иммуноглобулина. В случае отсутствия реакции через 30 минут дробно в три приёма с интервалом 10-15 минут вводят всю рассчитанную дозу иммуноглобулина, подогретого до 37°С, препарат для каждой порции набирают из нераскрытых ранее ампул. Рассчитанная доза иммуноглобулина должна быть инфильтрирована вокруг ран и в глубине раны. Если анатомическое расположение повреждения (кончики пальцев и т.п.) не позволяет вводить всю дозу вокруг ран, тогда остаток иммуноглобулина вводят внутримышечно в места, отличные от введения антирабической вакцины (мышцы ягодиц, верхнюю часть бедра, предплечье). Всю дозу антирабического иммуноглобулина вводят в течение 1 часа. В случае положительной внутрикожной пробы (отёк или покраснение 1 см и более) или в случае появлений аллергической реакции на подкожную инъекцию, иммуноглобулин вводят с соблюдением особой осторожности. Сначала рекомендуется ввести разведённый 1:100 препарат в подкожную клетчатку плеча в дозах 0,5 мл, 2,0 мл, 5,0 мл с интервалом 15-20 мин., потом — 0,1 мл неразведённого иммуноглобулина и через 30-60 мин  — вводят внутримышечно всю назначенную дозу препарата, подогретого до 37,5°С, дробно в три приёма с интервалом 10-15 минут.

«Гомологичный антирабический иммуноглобулин» (Россия)

СОСТАВ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА. Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови человека, раствор для инъекций, представля­ет собой концентрированный раствор очищенной гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови че­ловека, выделенной методом холодовой экстракции этанолом и подвергнутой процессу ультрафильтра­ции, очистки и вирусной инактивации при значении рН 4,0 и температуре 23-25 °С в течение 21 дня. Специфические антитела к вирусу бешенства, не менее 150 ME; стабилизатор глицин (гликокол) от 20 до 25 мг; натрия хлорид 7 мг; вода для инъекций. Препарат содержит специфические антитела, спо­собные нейтрализовать вирус бешенства. Максимальная концентрация антител достигается через 2-3 дня после внутримышечного введения ан­тирабического иммуноглобулина. Период полувы­ведения антител составляет от 3 до 4 недель.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ И ДОЗИРОВКА.

Немедленно или как можно раньше после укуса или повреждения проводят обязательную местную об­работку раны. Постановка кожного теста перед введением не требуется. Препарат вводят в как можно более ранние сроки после обращения однократно в дозе 20 МЕ/кг массы тела взрослого или ребенка. Как можно большая часть рассчитанной дозы долж­на быть инфильтрирована вокруг раны, если это возможно анатомически. Остальная часть должна быть введена внутримышечно в наружную верхнюю ягодичную область взрослым, либо в переднебоковую область бедра детям. У детей (особенно имею­щих множественные ранения) доза антирабическо-го иммуноглобулина из сыворотки крови человека может быть разведена в 2-3 раза 0,9% раствором натрия хлорида для инъекций до объема, обеспечи­вающего полноценную инфильтрацию пораженных участков тела. Введение антирабического иммуноглобули­на из сыворотки крови человека должно осу­ществляться за 10-15 минут до антирабической вакцины. Необходимо строго соблюдать, последовательность введения антирабических препаратов. В случаях позднего обращения пострадавшего за антирабической помощью антирабический иммуног­лобулин из сыворотки крови человека может быть введен не позднее 7 дня после контакта с больным бешенством или подозрительным на бешенство жи­вотным. Введение антирабического иммуноглобулина в более поздние сроки, а также после введения антирабической вакцины не допускается. Дозировка иммуноглобулина не должна превы­шаться ни при каких обстоятельствах, так как введение повышенной дозы иммуноглобулина может частично подавить продукцию антител.

Иммуноглобулин антирабический и антирабическая вакцина должны вводиться в разные участки тела с использованием различных шприцов. При необходимости экстренной профилактики столбняка последнюю осуществляют после введе­ния иммуноглобулина антирабического и первой прививки антирабической вакцины. Препарат изготовляется из сыворотки людей, иммунизированных против бешенства. Выпускается в жидком виде, дозируется в МЕ/мл (в 1 мл препарата должно быть не менее 400 МЕ).

«Иммуноглобулин Имогам Рабис» (Франция)

Гомологичный антирабический иммуноглобулин для профилактики бешенства 150 МЕ; в состав иммуноглобулина входят глицин и меркуротиолят; назначение – см. антирабический гомологичный иммуноглобулин (Россия).

«Сыворотка Сером антирабик 1000 МЕ Пастер» (Франция)

Гетерогенная антирабическая сыворотка, содержащая минимум 1000 МЕ; в качестве консерванта – крезол. Количество применяемой сыворотки должно определяться из расчета 40МЕ/кг веса тела с предварительным определением чувствительности к чужеродному белку; половина дозы вводится внутримышечно вдали от места инъекции вакцины, вторая половина должна быть применена в виде глубоких инсталяций в рану и инфильтрована вокруг нее.

«Вакцина Верораб» (Франция)

Инактивированная сухая вакцина для профилактики бешенства содержит штамм вируса бешенства Wistar, Rabies РМ/Wi 38-1503-3м, культивируемый на культуре клеток ВЕРО; активность равна или превышает 2,5 МЕ. Показания – см.антирабическую инактивированную культуральную вакцину. Использовать с осторожностью у лиц с аллергией к стрептомицину и/или неомицину (в вакцине присутствуют следовые количества этих антибиотиков).

«Вакцина ХДСВ» (Франция)

Инактивированная вакцина для профилактики бешенства; содержит вакцинный штамм вируса бешенства Wistar, Rabies РМ/Wi 38-1503-3м, выращенный на культуре диплоидных клеток человека, инактивированный бета-пропиолактоном; активность равна или превышает 2,5 МЕ. Показания – см. антирабическая инактивированная культуральная вакцина. Использовать с осторожностью для лиц с аллергией к неомицину (в вакцине присутствуют следовые количества этого антибиотика).