Микробиологическая диагностика

Материалом для исследования являются мазки из зева, носоглоточные смывы, мокрота, плевральный выпот, отделяемое влагалища, уретры, синовиальная жидкость.

При бактериоскопии используется прямой вариант МФА (РИФ). Мазки фиксируют в ацетоне и окрашивают люминесцирующим иммуноглобулином M. hominis, M. pneumoniae или U. urealyticum во влажной камере. Стекла дважды промывают в фосфатно-буферном растворе (pH 7,2-7,4) и ополаскивают дистиллированной водой. Препараты высушивают и изучают в люминесцентном микроскопе. Микоплазмы выявляются в виде ярко-зеленого свечения на мембранах эпителиальных клеток и в межклеточном пространстве. При ограниченном количестве эпителиальных клеток в исследуемом материале положительная оценка предполагает выявление в препарате не менее 10 ярко-зеленых гранул, четко выделяющихся на красноватом фоне препарата.

Для культивирования микоплазм используют плотные и жидкие питательные среды. Жидкая питательная среда содержит: стерильный бульон из триптического перевара сердца крупного рогатого скота; нормальную лошадиную сыворотку без консерванта; дрожжевой экстракт; раствор таллия уксуснокислого, пенициллин или ампициллин. Плотная среда содержит дополнительно агар-агар. Посевы инкубируют при 37⁰С в аэробных условиях при повышенной влажности, для выделения M. pneumoniae до 30 суток, при исследовании на другие виды микоплазм – до 14 суток. Колонии микоплазм изучают под микроскопом, так как они имеют очень мелкие размеры (см. выше). Для выделения чистой культуры колонию пересевают методом агарового блока. Обожженным лезвием вырезают квадратный кусочек агара с намеченной колонией. Блок агара помещают на поверхность свежей питательной среды так, чтобы колония соприкасалась со средой, с легким нажимом пермещают блок штрихом 2-3 см и оставляют в конце штриха на весь период инкубации, так как под ним часто наблюдается рост микоплазм. Пересев колоний в жидкую среду также выполняют путем переноса агарового блока. Идентификацию осуществляют по культурально-ферментативным признакам (см. приложение 9)

Для выявления Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis часто используется метод, основанный на метаболических свойствах данных микроорганизмов (цветной тест): Ureaplasma urealyticum гидролизует мочевину с помощью уреазы, Micoplasma hominis гидролизует аргинин. Образование аммония приводит к алкализации среды. В результате данной реакции при наличии в питательной среде соответствующего субстрата и индикатора цвет ее изменяется.

Например, при росте уреаплазм, содержащихся в исследуемом материале, который вносят в пробирку с 2 мл индикаторной среды, цвет среды меняется от лимонно-желтого до зеленого (цвет зависит от вида индикатора), а при большом содержании возбудителя - до синего во всей пробирке без помутнений и осадка. Рост уреаплазм наблюдается в течение 24 ч, реже 48 ч. Ампициллин, содержащийся в средах обеспечивает ингибирование роста других бактерий.

В качестве питательной среды можно использовать бульон U₉ и аргининовый бульон (фирмы Mereux). Эти среды обогащены факторами, обеспечивающими рост микоплазм (PPLO бульон, экстракт дрожжей, сыворотка лошади, пептоны). Они включают также вещества, необходимые для демонстрации метаболических свойств (мочевина в U₉ и аргинин в аргининовом бульоне и РН индикатор (феноловый красный).

Возможно применение цветного теста с последующим культивированием на твердой среде (субкультивация). Достаточно прост также метод прямого посева на плотную питательную среду, содержащую индикатор.

Для подтверждения диагноза используются серологические методы: РСК, РПГА, ИФА, а также реакцию ингибиции метаболизма. РСК, РНГА, ИФА ставят по стандартным методикам.

В РСК специфические антитела появляются в конце первой или начале второй недели, достигают максимума на 3-4 неделе и держатся до 3-6 месяцев, затем резко снижаются и исчезают к году. Диагностическое значение имеет увеличение титра антител в 4 раза и более при исследовании парных сывороток. Иногда в случае не ясной эпидемиологической ситуации РСК ставят одновременно с микоплазменным, риккетсиозным и пситтаккозным диагностикумами (см. приложение 10).

Антитела, выявляемые с помощью РНГА и ИФА, появляются в конце инкубационного периода, достигают максимума в конце первого месяца заболевания, затем титр их снижается и исчезает через год

Ингибирующие метаболизм антитела достигают максимума к 6 месяцам и могут сохраняться до двух лет. Реакция ингибиции метаболизма микоплазм основана на свойстве M. pneumoniae ферментировать глюкозу со сдвигом pH среды, что определяется по изменению цвета индикатора. При добавлении исследуемой сыворотки больного подавляется ферментативная активность микоплазм и цвет среды остается прежним.

Широко используются молекулярно-биологические методы (гибридизация ДНК, ПЦР). Имеются данные о выявлении ДНК возбудителя в любом из вышеуказанных материалов для исследования. Разработанные зонды содержат видоспецифические участки ДНК и представляют собой природные плазмиды микоплазм либо искусственно синтезированные олигонуклеотиды (на основе вариабельных участков рибосомальных генов).

В ряде случаев может быть использована внутрикожная проба.

Лечение. Микоплазмы чувствительны к тетрациклинам, макролидам, фторхинолонам, цефалоспоринам, азалидам. Наиболее эффективна направленная этиотропная терапия.