130. Культивирование вирусов. Культуры клеток: виды, методы заражения. Индикация и идентификация вирусов в культуре клеток. Типы цпд. Вирусные включения: природа, локализация, значение.

Метод культур клеток. Для приготовления культур клеток используют различные ткани человека и животных. Чаще применяют культуры клеток из эмбриональных (куриные фибробласты, человеческие фибробласты) и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих активной способностью к росту и размножению.

Различают три типа культур клеток: однослойные культуры клеток; культуры суспензированных клеток; органные культуры.

Однослойные культуры клеток по числу жизнеспособных генераций разделяют на первичные или первично трипсинизированные (куриные фибробласты, человеческие фибробласты); перевиваемые (способны размножаться в лабораторных условиях длительное время); полуперевиваемые (способны размножаться в течение 40-50 пассажей).

Первичные культуры кл.— это кл. какой-либо ткани, способные культивироваться в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности в спец. питательной среде, но не способные к длительному размножению. Срок жизни таких культур ограничен. Их получают из ткани после механич. измельчения, обработки протеолитическими ф-тами и стандартизации кол-ва кл.

Полуперевиваемые (диплоидные)— кл.одного генотипа, способные in vitro выдерживать до 50100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона ч-ка используются для диагностики вирусных инф. и при пр-стве вирусных вакцин.

Перевиваемые кл.линии х-ся бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные кл.культуры (СОЦ — из сердца обезьяны циномольгус, ПЭС — из почек эмбриона свиньи), отдельные кл. которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению в кл. таких свойств, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.

Др. источник перевиваемых кл. линий — злокачественные новообразования. В этом случае трансформация кл. происходит in vivo. Применяются следующие линии перевиваемых кл.: HeLa — получена из карциномы шейки матки; Hep-2 — из карциномы гортани; Детройт-6 — из метастаза рака легкого в костный мозг; RH — из опухоли почки ч-ка.

Трансфецированные культуры кл. Разработаны экспериментальные линии культур кл. методом трансфекции (переноса) генов вирусов, контролирующих биосинтез поверхностных АГ. Такие культуры кл. экспрессируют поверхностный б.опред. вируса (HBs-антиген, gp120) на мембране. Такие культуры используются для изучения иммунологических мех-мов патогенеза вирусных инф., разработки химиотерапевтических и иммунобиологических препаратов.

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред – наличие 5-10 % сыворотки крови животных (телячьей, бычей, лошадиной), без наличия которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном состоянии при постоянном интенсивном перемешивании среды. Они используются для накопления вирусов.

Некоторые вирусы размножаются в органных культурах – это кусочки органов, выращенные вне организма и сохраняющие структуру данного органа.

Выделение вирусов в культурах клеток

При выделении вирусов из различных инф. материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые, смывы из органов) применяют культуры кл, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры с хорошо развитым монослоем кл. Перед заражением питат. среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,10,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного а\б для уничтожения бактерий и грибов. После 3060 мин. контакта вируса с монослоем кл.удаляют избыток материала, в культуру вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

О размножении вируса в культуре клеток судят по следующим признакам: цитопатогенному действию (ЦПД); образованию в клетках включений; появлению бляшек; феномену гемадсорбции; цветной пробе.

Цитопатогенное действие может проявляться полной дегенерацией клеток – слущиванием клеток с поверхности стекла после их гибели (энтеровирусы полиомиелита, Коксаки); частичной дегенерацией – округлением клеток, слиянием и образованием симпластов (вирус кори).

Образование включений в клетках – это скопление вирионов или отдельных компонентов в цитоплазме или в ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения – тельца гварниери, вирусы герпеса, аденовирусы – внутриядерные включения.

Появление бляшек – зоны клеток, разрушенных вирусом (негативные колонии вирусов), обнаруживают в клеточных культурах, растущих на стекле и покрытых тонким слоем агара. Бляшки различаются по величине, форме, времени появления, поэтому данный тест используют для дифференциации вирусов.

Реакция гемадсорбции заключается в способности клеток, зараженных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты, потому что эти клетки несут на поверхности гемагглютинины вируса.

Цветная реакция основана на изменении цвета питательной среды с индикатором, используемой для культур клеток. При росте клеток, не пораженных вирусом, идет накопление продуктов метоболизма, которые изменяют цвет питательной среды. При репродукции вирусов в культуре нарушается метаболизм клеток, и среда сохраняет первоначальный цвет.

При отсутствии ЦПД можно поставить реакцию интерференйии – исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная), если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

131. Культивирование вирусов в курином эмбрионе: методы заражения, индикации и идентификации вирусов. Культивирование вирусов на лабораторных животных: методы заражения, индикации и идентификации вирусов.