21.22.23Лекция

24.25

Вода, как и почва, является естественной средой обитания многих микроорганизмов. Видовой состав микрофлоры воды имеет много общего с микрофлорой почвы. Кроме того, в воде живут различные виды вибрионов, спириллы, железо- и серобактерии, светящиеся бактерии и др. Микроорганизмы воды, как и микроорганизмы почвы, имеют большое значение в круговороте веществ в природе. В воде происходят процессы аммонификации, нитрификации, денитрификации и брожения.

Характер микрофлоры воды зависит от разных причин. Чем больше вода загрязнена органическими соединениями, тем больше микроорганизмов она содержит. Особенно много их в открытых водоемах и реках вблизи населенных пунктов, где вода загрязняется стоками хозяйственных и фекальных нечистот. По мере удаления от населенных пунктов число микроорганизмов постепенно уменьшается.

Вода морей и океанов заселена микробами, которые приспособились к повышенному содержанию солей, большому давлению воды и низкой температуре. В поверхностном слое придонного ила содержится особенно много микробов, которые образуют на нем как бы пленку. Наиболее чистыми являются воды глубоких артезианских скважин и родников. Воды этих источников могут быть использованы для питья без предварительной их обработки и обезвреживания.

С санитарной точки зрения наибольший интерес представляют процессы самоочищения воды открытых водоемов от загрязняющих их органических веществ животного и растительного происхождения и от попавших в них болезнетворных микробов. Быстрое разложение органических соединений и самоочищение воды водоемов происходят в связи с жизнедеятельностью сапрофитной водной микрофлоры.

В открытых водоемах условно различают три зоны:

1) зона сильного загрязнения, вода которой содержит значительное количество органических веществ и бедна кислородом, — полисапробная зона. Микрофлора здесь наиболее обильна и представлена преимущественно анаэробными возбудителями гнилостных и бродильных процессов;

2) зона умеренного загрязнения — мезосапробная, где происходит интенсивная минерализация органических веществ. Количественный и качественный состав сапрофитных микробов в этих зонах весьма разнообразен;

3) зона чистой воды — олигосапробная, в которой органических соединений почти нет и где процессы минерализации закончены. Здесь встречаются различные представители нормальной водной микрофлоры.

Процессы самоочищения воды от посторонней для нее микрофлоры зависят от ряда факторов: гибели микробов в поверхностных слоях воды под действием солнечных лучей, разбавления загрязненных вод более чистыми, механического осаждения микробных тел, подавления жизнедеятельности микробов под влиянием различных химических примесей и антибиотических продуктов, вырабатываемых водорослями, грибами и другими микроорганизмами, конкуренции между отдельными микробными группами, пожирания микробов простейшими и другими организмами. Совокупность всех факторов приводит к тому, что даже в неблагоприятных водоемах с течением времени и по мере удаления от источников загрязнения качество воды улучшается.

Вода имеет большое эпидемиологическое значение как фактор передачи инфекции. Водные эпидемии различных инфекционных болезней (холера, брюшной тиф, дизентерия, туляремия, лептоспирозы и др.) известны давно. Загрязнение воды патогенными микробами обычно происходит через сточные воды, при купании людей и животных и т. д. Выживаемость патогенных микробов в воде колеблется в широких пределах в зависимости от ее качества. Для предупреждения передачи патогенных микробов через воду применяют меры санитарной охраны водоемов и источников водоснабжения, а также очистку и обезвреживание питьевых и хозяйственных вод.

26. Исследование воды на общую бактериальную обсемененность и определение санитарно-показательных микроорганизмов

Общее количество бактерий в воде определяют путем посева воды в стерильные чашки Петри, в которые затем добавляют расплавленный и остуженный до 42—45°С агар. При исследовании чистой воды засевают 1 мл, а при исследовании загрязненных вод делают посевы по 1 мл определенных разведений воды (1 : 10— 1 : 100 и более). Чашки помещают в термостат при 37°С на 24 ч (или при 20—22°С на 48 ч) и по истечении срока инкубации подсчитывают все колонии, выросшие как на поверхности агара, так и в глубине его, выбирая чашки, в которых наиболее удобно произвести подсчет колоний.

Общее количество бактерий определяют в пересчете на число колоний, выросших при посеве 1 мл воды. Считают, что в чистой воде общее количество бактерий должно быть не более 100 в 1 мл воды, в воде сомнительной чистоты— от 100 до 1000, в загрязненной — свыше 1000. Общее количество бактерий в 1 мл водопроводной воды не должно превышать 100; для колодцев и открытых водоемов допускают до 1000.

Определение санитарно-показательных микроорганизмов. Интенсивность фекального загрязнения воды характеризуют два показателя: 

1) индекс кишечной палочки (коли-индекс)—количество БГКП, обнаруженное в 1 л воды;

2) титр кишечной палочки (коли-титр) — наименьшее количество миллилитров воды, в котором обнаруживают БГКП.

Для определения количества БГКП используют метод мембранных фильтров, который основан на концентрировании определенных объемов воды на мембранных фильтрах с последующим посевом их на среду Эндо. Бродильные (титрационные) методы, предусматривают посев определенного количества воды на среды обогащения, а метод прямого посева — определенных разведений воды на среду Эндо. Бродильный метод удлиняет срок анализа на сутки.

Выбор метода исследования зависит от качества воды. Чистые воды, которые хорошо фильтруются (вода централизованного водоснабжения), исследуют методом мембранных фильтров. Если воды содержат различные примеси, применяют метод бродильных проб. Метод прямого посева на среду Эндо используют редко, при исследовании сильно загрязненных проб воды.

При определении БГКП учитывают все разновидности кишечной палочки, дифференцируя колонии по лактозному признаку, оксидазному тесту и ферментации глюкозы. Метод мембранных фильтров. Сущность метода заключается в концентрации БГКП из определенного объема воды на мембранном фильтре, выращивании их при 37°С на среде Эндо, дифференциации выросших колоний и определении коли-индекса. Мембранные фильтры представляют собой проницаемые для воды нитроцеллюлозные пленки с порами разного диаметра в зависимости от номера фильтра. Для фильтрации воды централизованного водоснабжения используют фильтры № 2 и 3, диаметр пор которых меньше диаметра бактериальной клетки, а для, загрязненной воды применяют еще и фильтры № 6, задерживающие крупные частицы, взвешенные в воде. Перед употреблением фильтры стерилизуют 10 мин кипячением в дистиллированной воде, меняя ее 3—5 раз. Мембранные фильтры помещают в фильтровальный аппарат Зейтца. Фильтруют не менее 300—500 мл чистой воды, 100—10—: 1 мл или по 1 мл соответствующих разведений более загрязненной воды. После фильтрации пробы воды мембранный фильтр переносят на среду Эндо, разлитую в чашки Петри. Поверхность фильтра с осевшими на не микробами должна быть обращена вверх. Посевы выдерживают в термостате при 37°С в течение 18—24 ч. Если на фильтрах вырастают колонии, характерные для БГКП: красные, темно-красные с металлическим блеском или без него (лактозоположительные), из них готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При наличии грамотрицательных, не образующих спор палочек ставят тест на наличие оксидазы. Число колоний, не обладающих оксидазной активностью, подсчитывают и при содержании; их более трех в 1 л питьевой воды и более десяти в 1 л воды колодцев немедленно дают ответ о наличии БГКП в количестве, превышающем норму. Сомнительные колонии— розовые с темным центром и бесцветные, содержащие грамотрицательные палочки и дающие отрицательный результат пробы на оксидазу, пересевают в полужидкую среду с глюкозой (2—3 колонии). При образовании кислоты и газа через 5—6 ч пребывания в термостате при 37°С выделенную культуру также относят к БГКП.

Отрицательный ответ об отсутствии в пробе воды БГКП дают при отсутствии роста на фильтре колоний кишечной палочки через 18—24 ч, а также рри наличии колоний, обладающих оксидазной активностью.

Результаты анализа выражают в виде коли-индекса, который высчитывают, умножив количество выросших колоний БГКП на 1000 и разделив на объем профильтрованной воды.

При исследовании воды открытых водоемов и сточных вод на фильтре подсчитывают только число лактозоположительных колоний кишечной палочки — ЛКП (темно- красные с металлическим блеском и без него). Наличие характерной морфологии, отрицательного теста на оксидазу свидетельствует о присутствии БГКП. При нетипичном росте, отсутствии реакции на оксидазу и в спорных случаях производят посев подозрительных колоний на полужидкую среду с лактозой и определяют ферментацию до кислоты и газа при 37°С. Учетом только лактозоположительных кишечных палочек можно закончить исследование воды водоемов (пресных и соленых) в местах хозяйственно-бытового и культурного водопользования, на этапах очистки питьевой воды, необеззараженных сточных вод и воды открытых водоемов.

Все БГКП (лактозоположительные и лактозоотрицательные варианты) определяют при изучении процессов самоочищения воды, при изучении искусственных водоемов (водохранилищ и каналов), выборе нового источника водоснабжения, преобладании на фильтре розовых оксидазоотрицательных колоний.

Титрационный (бродильный) метод. Сущность бродильного метода заключается в посеве определенного количества воды на жидкие питательные среды накопления, подращивании БГКП при 37° с последующим высевом на плотные питательные среды (среда Эндо), дифференциации выросших колоний и определении БГКП в 1 л воды. Выбор объема исследуемой воды зависит от характера водоисточника. Выбранные объемы проб засевают во флаконы и пробирки с глюкозопептонной или лактозопептонной средой, внося 100 и 10 мл воды в 10 мл или 1 мл концентрированной среды, а 1 мл воды или 1 мл соответствующего разведения воды — в пробирки с 5 мл среды обычной концентрации. Инкубируют при 37° С в течение 24 ч и делают высев на среду Эндо (с расчетом получения роста изолированных колоний) из каждого флакона и пробирки, где наблюдают помутнение, образование кислоты и газа или только помутнение и образование кислоты. Посевы выдерживают при 37°С в течение 16— 18 ч. При росте на среде Эндо темно-красных с металлическим блеском или без него колоний, в которых при микроскопии обнаруживают грамотрицательные палочки, не обладающие оксидазной активностью, ответ о присутствии БГКП выдают через 40—42 ч. При росте на среде Эндо розовых или бесцветных колоний, оксидазонегативных, содержащих грамотрицательные палочки, их отсевают на среду с глюкозой. Образование кислоты и газа в пробирке с этой средой через 24 ч инкубирования при 37°С свидетельствует о наличии БГКП. Результаты исследования выражают коли-индексом, величину которого определяют по таблице.

Отрицательный ответ «БГКП не обнаружены» может быть выдан при отсутствии изменения среды накопления (или при наличии помутнения без образования кислоты) через 24 и 40—42 ч, если на среде Эндо нет роста колоний, характерных для БГКП. Оксидазоположительные красные или розовые колонии, или оксидазоотрицательные колонии, содержащие грамположительные палочки или кокки не учитываются.

Определение оксидазной активности колоний БГКП проводят непосредственно на мембранном фильтре, который переносят на фильтровальный лист бумаги и смачивают реактивом. Через 2—5 мин его помещают обратно на среду Эндо и учитывают результаты. При отрицательной реакции цвет колоний не меняется, при положительной— колонии изменяют цвет на сине-фиолетовый.

При бродильном методе фильтровальную бумагу смачивают реактивом, часть колонии со среды Эндо переносят штрихом на бумагу. При положительном результате реакции не позднее 1—2 мин штрих синеет, при отрицательном — не меняется. Реактив можно закапать непосредственно на колонию или сектор посева на среде Эндо. Следует помнить, что реактив обладает бактерицидными свойствами, поэтому колонии для дальнейших исследований непригодны.

При отсутствии реактива для оксидазного теста делают прямой посев или высев со среды накопления на модифицированную среду Эндо с молоком или желатином. Дифференцируют БГКП от других грамотрицательных палочек, которым не придают санитарно-показательного значения, по наличию у последних протеолитической активности: образованию кратера на среде с желатином или зоны протеолиза (просветления вокруг колонии) на среде Эндо с молоком.

Дополнительные исследования, выявляющие наличие фекальных кишечных палочек (ФКГІ) —показателей свежего фекального загрязнения, проводят путем постановки теста ферментации лактозы до кислоты и газа при 43— 45°С, засевая колонии в желчно-лактозную среду с бриллиантовым зеленым, или лактозный бульон с борной кислотой, или полужидкую среду с лактозой. Наличие кислоты и газа при инкубации в течение 24 ч при 43—44,5°С, а также отсутствие роста на среде Козера (отношение к солям лимонной кислоты) указывает на свежее фекальное загрязнение воды.

Качество питьевой воды определено ГОСТ 2874-73, в котором предусмотрено как норма:

1) общее количество бактерий в 1 мл воды не более 100; 

2) количество БГКП в 1 л воды (коли-индекс) на плотных питательных средах (при использовании метода мембранных фильтров) не более 3, а при использовании жидких сред накопления коли-титр не менее 300. Вода питьевая, забираемая из колодцев, регламентирована «Санитарными правилами по устройству и содержанию колодцев» (Минздрав СССР, 1975), в которых предусмотрено БГКП не более 10 в 1 л, а коли-титр не менее 100. ГОСТ 17.1.3.03-77 определяет правила выбора и оценки качества источников централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения. Вода поверхностных источников хозяйственно-питьевого водоснабжения не должна содержать возбудителей кишечных заболеваний, а число БГКП должно быть не более 10 000 в 1 л воды. Вода плавательных бассейнов отвечает требованиям рекомендации Минздрава СССР 1976 г., если ее коли-титр не менее 100. Минеральные воды должны иметь коли-титр более 300 и микробное число не более 100 в 1 л (ГОСТ 13273-67). Сточные воды считаются достаточно обеззараженными при коли-титре не менее 1, коли-индексе не более 1000 в 1 л, при наличии остаточного хлора не менее 1,5 мг/мл.