Методы замораживания-скалывания, замораживания-травления
Некоторую информацию о расположении мембранных белков дали новые электронно-микроскопические методы, ставшие теперь уже классическими – методы замораживания-скалывания и замораживания-травления. В этом случае препараты быстро замораживают, не подвергая их каким-либо повреждающим действиям.
После замораживания образец, представляющий собой суспензию клеток или мембран, скалывают с помощью ножа при низкой температуре (–1000ºС) в глубоком вакууме. При этом мембрана раскалывается по своей срединной области и расщепляется на две половинки. В результате на образовавшихся плоскостях скола обнажается внутренняя область мембраны.
При необходимости образец подвергают травлению – проводят обычную возгонку льда в вакууме. Это позволяет лучше визуализировать поверхностные структуры клеточных мембран.
Процесс подготовки препарата включает следующие операции (рис. 32):
Рис. 32. Исследование мембран методом замораживания-скалывания. А – плоскость скола замороженной клетки частично проходит через центральную часть различных мембран. Б – разъединение двух половинок. В – образец подвергают травлению для выявления деталей поверхности слоя. Г – на образец напыляют слой платины, а затем слой углерода получая реплику с поверхности образца. Д – эту реплику отделяют от препарата и исследуют под электронным микроскопом.
Рис.3 Микрофотография мембраны приготовленной методом замораживания-скалывания. При этом мембрана раскалывается на две поверхности: P-поверхность – гидрофобная часть внутреннего слоя мембраны, Е-поверхноть – гидрофобная часть внешней половины бислоя. На микрофотографии видны отверстия от интегральных белков, оставшиеся при скалывании. Сами белки остались на другой половине липидного бислоя. [Rees, 1996]
Наиболее характерные структуры, наблюдаемые при изучении мембран методом замораживания – скалывания, – это многочисленные внутримембранные частицы диаметром от 8 до 10 нм, лежащие в плоскости мембранных сколов.
Обычно они расположены хаотично, но иногда образуют группы. Вероятнее всего, эти частицы являются мембранными белками. При электронной микроскопии тонких срезов подобные структуры не обнаруживаются.
Реплики, полученные от двух половинок расщепленной мембраны, не всегда топологически комплементарны. Это означает, что некоторые частицы связаны только с одной из половин мембраны.
Данные, полученные методом замораживания-скалывания, широко использовались С. Сингером и Дж. Никольсоном при создании жидкостно-мозаичной модели мембран, поскольку они убедительно показывали, что глобулярные белки находятся не только на поверхности мембраны, но и внутри бислоя (!!!).