Аудиторная работа

Лабораторная работа (цветные реакции, обнаруживающие белок и аминокислоты)

1. Биуретовая реакция открывает в белке пептидную связь (-СО-NН-), образующуюся в результате взаимодействия карбоксильной и аминогруппы альфа-аминокислот при отнятия воды. Название реакции происходит от производного мочевины – биурета, имеющие группировки, характерные для белковой молекулы. (-СО- NН-).

Химизм реакции: при добавлении сернокислой меди в сильно основной раствор белка образуются комплексные соединения меди, окрашенные в красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет.

Ход работы: к 5 каплям раствора белка добавить 3 капли 10%-ого раствора едкого натрия и 1 каплю 1%-ого раствора сернокислой меди, смешать – появляется сине-фиолетовое окрашивание.

2. Нингидриновая реакция выявляет -аминогруппы: растворы белка, -аминокислот и пептидов при нагревании с нингидрином приобретают фиолетовое окрашивание.

Ход работы: К 5 каплям раствора белка добавить 5 капель 0,1% -ого раствора нингидрина, кипятить 1-2 мин – появляется розово-фиолетовое или сине-фиолетовое окрашивание.

3. Ксантопротеиновая реакция открывает в белках циклические аминокислоты. Большинство растворов белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой приобретают желтое окрашивание, переходящее в оранжевое при подщелачивании.

Химизм: Реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца соответствующих аминокислот с образованием нитросоединений желтого цвета.

Ход работы: К 5 каплям раствора белка добавить 3 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно кипятить. Появляющийся осадок белка окрашивается в желтый цвет. После охлаждения прилить по каплям 10%-ный раствор едкого натрия до появления оранжевого окрашивания.

4. Реакция Миллона открывает в белках циклическую аминокислоту тирозин, имеющую фенольную группировку, которая, взаимодействуя с реактивом Миллона (смесь азотнокислых солей закиси и окиси ртути в концентрированной азотной кислоте), образует ртутную соль красного цвета. Белки, не содержащие тирозина, этой реакцией не обнаруживаются. При избытке реактива Миллона появление окраски (красного цвета) может быть замаскировано ксантопротеиновой реакцией за счет азотной кислоты.

Ход работы: К 5 каплям раствора белка прилить 3 капли реактива Миллона – появляется осадок белка, который при осторожном нагревании окрашивается в кирпично-красный цвет.

6. Реакция Фоля позволяет обнаружить в белке аминокислоты (цистин и цистеин), содержащие непрочно связанную серу.

Химизм: при кипячении белка со щелочью цистин и цистеин теряют серу в виде сероводорода, который со свинцом образует черный или серый осадок сернистого свинца (реактив Фоля состоит из 5%-ого раствора уксуснокислого свинца и избытка 10%-ого раствора едкого натра).

Ход работы: К 5 каплям раствора белка прилить 5 капель реактива Фоля, нагреть до кипения и оставить на 1 или 2 мин – появляется бурый или черный осадок сернистого свинца.

После выполнения проб каждому студенту необходимо индивидуально проделать следующее: в пробе жидкости, полученной у преподавателя, установить наличие белка или аминокислот (при обнаружении аминокислот определить тип). Письменно аргументируйте результат исследования.

Дайте письменно обоснованные ответы на следующие вопросы:

1. Исследуемая биологическая жидкость при нагревании с нингидрином приобретает фиолетовое окрашивание. Содержатся ли в исследуемой жидкости белки?

2. Можно ли установить присутствие свободных аминокислот в растворе белка, располагая реактивами только для нингидриновой пробы?

3. Будет ли положительной биуретовая реакция с раствором белка после длительного кипячения в присутствии серной кислоты?

4. Будет ли положительной биуретовая реакция с раствором белка после кратковременного нагревания?

5. Выберите из представленных аминокислот протеиногенную:

а. R- CH(NH ₂ )-CH ₂ –CH₂ –COOH .б. R- CH ₂- CH (NH ₂ ) –CH₂ –COOH

в. R- CH ₂-CH ₂ –CH (NH ₂) –COOH

6. Определите суммарный заряд молекул аминокислот, представленных в таблице, при различных значениях рН и заполните таблицу:

Название аминокислоты	суммарный заряд молекулы
	рН 7,0	рН 3,0	рН 11,0
асп лиз ала

Сравните Ваши ответы с эталонными ответами. Выявите с помощью лекций и учебника причину Ваших ошибок.

Занятие 3. Структура и физико-химические свойства белков. Высаливание белков.

Цель: Изучить уникальную структуру белков, их основные физико-химические свойства и функции. Познакомиться с принципами современных методов исследования белков.

Студент должен знать:

1. Функции белков.

2. Чем обусловлена способность белка специфично связываться с различными веществами (лигандами).

3. Уровни организации белковой молекулы и связи их обусловливающие.

4. Содержание понятий «домен», «фолдинг», «шаперон».

5. Чем обусловлена растворимость белка в воде и факторы, влияющие на растворимость белка.

6. От чего зависит заряд белковой молекулы, содержание понятий «изоэлектрическая точка», «изоэлектрическое состояние».

7. Факторы, снижающие растворимость белка, содержание термина «высаливание», в каких целях используется высаливание.

8. Принцип разделения белков методом электрофореза.

10. Понятие «нативный» и «денатурированный белок»

11. Факторы, вызывающие денатурацию белка. Применение денатурирующих агентов в медицине.

12. Принципы классификации белков. Примеры.

13. Общая характеристика представителей отдельных классов простых белков.

Студент должен уметь:

1. Дифференцировать факторы, вызывающие осаждение белка, на факторы, вызывающие денатурацию и факторы, вызывающие осаждение нативного белка.

2. Ориентировочно (на уровне «растворим» или «плохо растворим») прогнозировать растворимость белка в воде по данным об его аминокислотном составе.

Студент должен получить представление:

1.О патологии, связанной с нарушением биосинтеза белка и фолдинг процесса.

2. Об использовании в медицинской практике свойства белков осаждаться тяжелыми металлами.

3. О принципах методов гельфильтрации, гельхроматографии.

4. О принципах современных методов количественного определения белка.

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

1.Знания о процессах растворения и диссоциации.

2. Осмотическое давление, его связь с ионным составом и концентрацией ионов.

3. Понятие о началах термодинамики.

4. Знания о принципах и технике колориметрии, спектрофотометрии и нефелометрии.

Задания для самоподготовки:

Изучите материал темы в соответствии с целевыми вопросами («студент должен знать») и письменно выполните следующие задания:

1. Заполните таблицу: Уровни организации белковой молекулы:

Уровень организации	Типы связей	Функциональные группы, участвующие в образовании связей	аминокислоты, участвующие в образовании этих связей
первичный вторичный третичный четвертичный

2. Какие белки называют олигомерными? Определите понятие «протомер»

3. Чем обусловлено многообразие белков?

4. На каком этапе формирования белковой молекулы необходимы шапероны? Что может произойти с молекулой белка при их отсутствии в клетке?

5. Запишите функциональные группы аминокислот, обусловливающую амфолитную природу белковой молекулы, выделяя важнейшие и второстепенные.

6. Напишите формулу трипептида, имеющего суммарный положительный заряд при рН 7,0.

В какой среде (нейтральной, кислой, щелочной) лежит ИЭТ (изоэлектрическая точка) данного пептида?

7.ИЭТ пептида равна 5,0. Какие аминок-ты преобладают в составе пептида?

8. Напишите формулы трипептида, содержащего вал, ала, глю и трипептид, содержащий глю, асп, вал. Сравните степень их растворимости; подчеркните фрагменты молекул, определяющие их растворимость.

9. Заполните таблицу: Факторы, вызывающие осаждение белка:

Факторы, вызывающие осаждение нативного белка	Факторы, вызывающие денатурацию

10. Составьте таблицу по образцу: Классификация белков:

Принцип классификации	Название классов (групп)	представители и их функции
1.Наличие простетической группы в составе молекулы белка. 2. ?	простые (протеины) сложные (протеиды)	?