Микроскопия

СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ

Микроскоп

Увеличение — физическое свойство линз объектива и окуляра. Увеличение микроскопа приблизительно оценивают как произведение увеличения объектива и увеличения окуляра (рис. 1-5).

Минимальный размер d наблюдаемого объекта определён формулой:

d  ,

где:  — половина угловой ширины конуса световых лучей, собираемых линзами объектива; n — коэффициент преломления среды, отделяющей изучаемый объект от линз объектива или конденсора;  — длина волны света. nSin — апертура.

Разрешение микроскопа — величина, обратная d. Чем больше апертура, тем выше разрешение, но при этом уменьшается глубина резкости. Повысить разрешение можно за счёт увеличения апертуры. Увеличить апертуру можно путём увеличения коэффициента преломления. Коэффициент преломления жидких сред (иммерсионные среды) больше коэффициента преломления воздуха (n = 1,0). В микроскопии используют несколько иммерсионных сред: масляную, глицериновую, водную.

Предел разрешения светового микроскопа определяется длиной световой волны и апертурой линз. Теоретически возможный предел разрешения светового микроскопа — 0,2 мкм (минимальное расстояние, на котором различимы два объекта).

Оптические артефакты. Объектив состоит из нескольких стеклянных линз. Первая линза — сферическая или полусферическая — предназначена для получения увеличенного изображения. Все остальные линзы корригируют оптические артефакты (аберрации).

 Хроматические аберрации. Фокусное расстояние линзы для лучей разной длины волны различно. Поэтому при использовании немонохроматического света формируемое линзой изображение предмета имеет окрашенные края. Хроматическиеаберрации устраняют ахроматические и апохроматические объективы.

 Сферические аберрации. Различие оптических свойств центральной и периферической частей сферической линзы — причина сферических аберраций. Их устраняют апохроматические объективы. Сферическая линза не позволяет одновременно фокусировать изображение по всему полю. Для устранения этого недостатка применяют специальные объективы — планахроматы и планапохроматы. Наилучшим объективом считают планапохромат с высокой числовой апертурой.

Рис. 1-5. Микроскоп. Этот оптический прибор позволяет наблюдать мелкие объекты. Увеличение изображения достигается системой линз объектива и окуляра. Зеркало, конденсор и диафрагма направляют световой поток и регулируют освещение объекта. Механическая часть микроскопа включает: штатив, предметный столик, макро- и микрометрический винты, тубус, тубусодержатель. [17]

Специальные виды микроскопии

Темнопольная микроскопия. Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые объекты. Наблюдаемый объект выглядит как освещённый на тёмном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты. При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные — фаза световой волны, что и используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии.

Поляризационная микроскопия — формирование изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновые волокна и миофибриллы).

Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии и применяется для получения контрастного изображения неокрашенных объектов. Специальная интерференционная оптика (оптика Номарского) нашла применение в микроскопах с дифференциальным интерференционным контрастом.

Люминесцентная микроскопия применяется для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от мощного источника проходит через два фильтра. Один фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Другой фильтр пропускает свет длины волны, излучаемой флюоресцирующим объектом. Таким образом, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра.

 Катехоловые амины. Объект может флюоресцировать после специальной обработки ткани. Так, катехоламины, включая адреналин и норадреналин, флюоресцируют после обработки ткани в парах параформальдегида при 60–80 °C. Метод разработан группой шведских учёных и известен как метод Фалька.

 Флюоресцирующие красители (флюоресцеин, родамин и др.) избирательно связываются со специфическими макромолекулами.

Сканирующий ближнепольный оптический микроскоп. В основе работы сканирующего ближнепольного оптического микроскопа лежит использование светового луча, диаметр которого меньше, чем длина волны источника, вследствие чего предел разрешения у такого микроскопа фактически отсутствует. Свет пропускают через субволновую диафрагму (отверстие с диаметром меньшим, чем длина волны используемого излучения). Исследуемый объект размещается непосредственно за отверстием в ближней зоне. Источник субдлинноволнового света размещают на расстоянии 10 нм и менее над объектом. Перемещая исследуемый объект или источник света (диафрагму с субволновым отверстием) в горизонтальном направлении, получают ближнепольное изображение поверхности образца, регистрируемое в виде распределения интенсивности оптического излучения в зависимости от положения диафрагмы. В качестве источника субдлинноволнового света обычно используют зонд, изготовленный путём растягивания расплавленного оптического волокна (плавленно–тянутый зонд), травления и др.; конусовидное остриё зонда покрывают металлом (например, алюминием с помощью его испарения). В источниках света используют мелкие люминесцирующие частицы (бусина размером 10 нм, размещённая на конце зонда, люминесцирующая под воздействием ультрафиолетового облучения). В этом случае прохождение света через объект регистрируют с помощью детектора, покрытого поглощающим ультрафиолет слоем.

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Просвечивающий электронный микроскоп

В просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) вместо света применяют пучок электронов (рис. 1-6). При создаваемой высокой разности потенциалов (ускоряющем напряжении 50−600 кВ) электроны, составляющие пучок, имеют очень малую длину волны, что позволяет получать изображение изучаемого объекта с высоким разрешением. Теоретически разрешение просвечивающего электронного микроскопа составляет 0,002 нм. Реальное разрешение современных микроскопов приближается к 0,1 нм. Для биологических объектов разрешение ПЭМ на практике составляет 2 нм.

Рис. 1-6. Просвечивающий электронный микроскоп. [120]

В качестве источника электронов используют термоионные электронные пушки или пушки автоэлектронной эмиссии. При этом источник должен обладать небольшими размерами и высокой мощностью, чтобы получить изображение образца достаточно ярким. Изучаемый образец устанавливают на сетчатой подложке. Сетчатые подложки для ПЭМ не должны электризоваться, иначе это может исказить траекторию электрона. Обычно подложки изготавливают из проводящих химически инертных и не испаряющихся в вакууме материалов, таких, как вольфрам, молибден, нержавеющая сталь, титан, серебро, платина, платино-иридиевые сплавы.

Электроны, испускаемые пушкой в виде пучка с высокой энергией, проходят в вакууме через систему комбинированных фокусирующих электронных линз. Комбинированные линзы состоят из магнитных и электростатических линз, которые обеспечивают упорядоченное движение электронов в пучке (по спирали) и уменьшают диаметр пучка. Прежде чем провзаимодействовать с изучаемым объектом, пучок замедляется, а далее проходит сквозь объект. Прошедший сквозь объект луч с помощью линз проецируется на люминесцирующий экран, на котором создаётся видимое увеличенное изображение объекта. Изображение регистрируют различными детекторами.

Электронная томография. Этим методом с помощью серии микрографий, сделанных под разными углами, можно получить суммарную картину трёхмерной структуры исследуемого объекта (например, клеточных органелл).

Сканирующий просвечивающий электронный микроскоп

С помощью сканирующего просвечивающего электронного микроскопа изучают структуру поверхности объекта, сканируя её с помощью тонкого электронного луча (диаметром в несколько ангстрем). Микроскоп даёт возможность изучать молекулы при субнанометровом разрешении.

В ходе исследования электронный луч фокусируется на небольшом участке объекта. Передвигая сфокусированный луч над объектом, получают общую картину изучаемой поверхности. Для улучшения разрешения применяют различную технику энергетического фильтрования электронов.

Сканирующая зондовая микроскопия

Сканирующие зондовые микроскопы позволяют получить изображение исследуемого объекта при его сканировании с помощью микроскопических игл  зондов, имеющих очень острые окончания. Зонды могут быть различными: механическими, электрическими, оптическими, тепловыми и проч. К сканирующим зондовым микроскопам относятся атомно-силовой микроскоп, сканирующий туннельный микроскоп, сканирующий ближнепольный оптический микроскоп, сканирующий тепловой микроскоп, сканирующий ионную проводимость микроскоп и др.

Атомно–силовой микроскоп

Атомно–силовая микроскопия позволяет получать трёхмерные изображения профилей поверхностей биологических объектов в нанометровом масштабе. С помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) можно исследовать размеры и конформацию как единичных молекул, так и их конгломератов, фиксированных к твёрдым поверхностям. С помощью АСМ можно манипулировать отдельными молекулами (например, перемещать их с места на место). В основе работы АСМ лежит сканирование поверхности изучаемого объекта с помощью тончайшего зонда (иглы). Диаметр окончаний зондов составляет обычно 1020 нм. Зонд закреплён на свободном конце выступающего кронштейна (кантилевера) (рис. 1-7). В ходе сканирования поверхности кантилевер изгибается. При этом между объектом и остриём зонда возникают небольшие силы взаимодействия [несколько пиконьютонов (пН) или наноньютонов (нН)]. Оптическая система, состоящая из диодного лазера и диодной линейки, весьма чувствительна к изгибам кантилевера. При перемещениях кантилевера силы взаимодействия изменяются, что проявляется в изменениях отражения лазерного луча. Перемещая образец под остриём зонда или зонд над образцом, получают полное изображение рельефа поверхности образца. Точность измерений достигает нескольких ангстрем. Атомно-силовой микроскоп способен выявлять рельеф образца с субнанометровым разрешением.

Рис. 1-7. Атомно-силовой микроскоп. Очень тонкое остриё, прикреплённое к миниатюрному кантилеверу, зондирует поверхность исследуемого объекта. Для сканирования поверхности образец перемещается с помощью пьезоэлектрического манипулятора. [120]

Сканирующий туннельный микроскоп

Сканирующие туннельные микроскопы позволяют изучать структуру поверхности образца с разрешающей способностью до отдельных атомов. В основе работы микроскопа лежит использование т.н. туннельного эффекта. В его основе лежит явление прохождения электронов через барьер, образованный разрывом электрической цепи, — очень малым расстоянием (туннельным зазором), создаваемым между остриём зонда и электропроводящей поверхностью исследуемого объекта (рис. 1-8, рис. 1-9). При исследовании мягкого биологического материала образец должен быть жёстко фиксирован на проводящем субстрате (например, молекула ДНК на кристалле золота). Для появления туннельного тока (туннелирования электронов) расстояние между остриём зонда и проводящим образцом должно составлять доли нанометра, а прикладываемое между ними напряжение — от единиц милливольт до вольт. При исследовании образца замеряется локальная плотность электронов в туннельном токе. Ток зависит также от химической природы зонда и образца, что даёт возможность исследовать электронные свойства изучаемого объекта.

Рис. 1-8. Принцип действия сканирующего туннельного микроскопа. Токопроводящее остриё зонда сначала приближают к образцу на расстояние около 1 нм. На таком близком расстоянии электроны туннелируют сквозь щель между острием и объектом. [120]

Рис. 1-9. Возникновение туннельного эффекта (туннелирование электронов). При уменьшении расстояния между остриём зонда и проводящим изучаемым объектом до нескольких ангстрем электроны могут преодолевать это расстояние. [120]

ДРУГИЕ ТЕХНОЛОГИИ ВИЗУАЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

Лазерная конфокальная микроскопия

Метод конфокальной сканирующей микроскопии позволяет получить оптические срезы путём послойного сканирования объектов по глубине (наподобие томографии) и производить пространственную реконструкцию флюоресцирующего объекта. Условие конфокальности, совпадение фокусов диафрагмы детектора и освещающего объект света, выполняется, если один и тот же объектив используется и для освещения объекта, и для детекции изображения. Другим важным условием этого метода является применение диафрагмы детектора с минимальным диаметром, что требует использование мощного источника света, а именно систему лазеров. Большое количество шаговых двигателей управляют положением объекта в фокусе конфокального микроскопа как в плоскости XY, так и по оси Z. Конфокальный микроскоп управляется от компьютера, а изображение объекта можно увидеть только на дисплее. Каждый оптический срез запоминается как отдельный файл, после чего с помощью программы воссоздается трёхмерное изображение объекта.

Рентгеновская микроскопия

Предел разрешения рентгеновского микроскопа (~30 нм) на 2–3 порядка выше, чем светового (~200 нм), поскольку длина волны  рентгеновского излучения на 2–3 порядка меньше длины волны видимого света. Как видно, по разрешающей способности рентгеновский микроскоп занимает промежуточное положение между световым и электронным микроскопом. Кроме высокого разрешения рентгеновская микроскопия имеет и другие важные преимущества: возможность исследовать необезвоженный (гидратированный) объект, работать с достаточно толстыми срезами до 10 мкм, получать высококонтрастное изображение без окраски, работать при атмосферном давлении, а не в вакууме, как в случае электронной микроскопии, что существенно упрощает конструкцию микроскопа, т.к. позволяет обойтись без сложной вакуумной техники. В рентгеновской микроскопии для фокусировки рентгеновских лучей используют явление их отражения изогнутыми зеркальными плоскостями или отражение от кристаллографических изогнутых плоскостей. В рентгеновском микроскопе, в отличие от электронного микроскопа, не используют электрические и магнитные линзы, т.к. как рентгеновские лучи инертны к электрическому и магнитному полям.

СИСТЕМЫ АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЙ

Прогресс компьютерных технологий позволил автоматически обрабатывать и анализировать изображения клеточных и тканевых структур, быстро сосчитывать однотипные морфологические элементы, оценивать размеры клеток и субклеточных структур.

Анализатор изображений включает микроскоп, цифровую или телевизионную систему ввода изображения (захват изображения, экспорт/импорт изображений в формате *.img, *.jpg, *.bmp, чёрно-белые изображения 8 бит, цветные 24 бит), компьютер и программное обеспечение. Система анализа изображения в реальном времени осуществляет статистическую обработку исследуемого объекта по интересующим параметрам, позволяет сохранять изображения микропрепаратов и результаты анализа в базе данных.

Морфометрические исследования. Автоматический анализ морфометрических параметров: площадь, периметр, диаметр, длина, ширина, факторы формы, габариты, координаты.

Фотометрия (денситометрия)  фотометрический анализ объектов по интенсивности яркости свечения или оптической плотности исследуемой структуры.

Хромосомный анализ позволяет проводить кариотипирование в ручном или автоматическом режимах, анализировать кариограммы и формировать заключение, сохранять полученные изображения в базе данных.

Автоматизированный анализ мазка крови. В объёме стандартного клинического анализа в мазке крови автоматически подсчитываются лейкоцитарная формула, число тромбоцитов в расчете на тысячу эритроцитов, оценивается анизоцитоз и пойкилоцитоз, строится эритрометрическая кривая (кривая Прайса–Джонса распределение эритроцитов по размеру диаметра и количеству). В зависимости от характеристик анализатора изображений пропускная способность системы варьирует от 20 до 30 мазков крови в час.

Анализ движения в клеточной культуре включает измерения скорости, расстояния и направления движения клеток и их отростков. Анализатор изображения должен включать СО₂ камеру, в которую помещается посуда с исследуемыми клетками, а также высокочувствительную телевизионную камеру, позволяющую проводить видеосъёмку в полной темноте.

Анализ морфологии и подвижности сперматозоидов. В образце нативного эякулята автоматически определяется количество сперматозоидов и оценивается их подвижность. На окрашенных мазках эякулята оцениваются морфометрические параметры сперматозоидов.

Анализ колоний бактерий  подсчёт и морфометрия колоний, статистическая обработка, сохранение изображений и результатов анализа в базе данных.

Виртуальный препарат создаётся автоматически из нескольких полей зрения микроскопа чтобы получить изображение гистологического препарата, который не помещается в одном поле зрения, и последующем изучении с имитацией перемещения по препарату. Захват изображения ведётся при максимальном увеличении микроскопа, что увеличивает возможности изучения препарата на мониторе компьютера.

Телемедицинская станция. Анализатор изображений может быть интегрирован в локальную, региональную или федеральную информационную систему, а полученное изображение микропрепарата отправлено на другую систему анализа изображения, например для удалённой консультации. Интеграция индивидуального анализатора изображений в федеральную информационную систему позволяет передавать в базу данных для хранения собственные оцифрованные микропрепараты и обратно из базы получать изображения и информацию для диагностики микропрепаратов.