Молекулярные методы исследования

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ БЕЛКА

Иммуноблот

С помощью иммуноблота (вестерн-блот, Western blot) выполняют качественный и количественный анализ белков-мишеней. Принцип метода основан на специфическом взаимодействии первичных АТ с искомым белком. Денатурированный белковый экстракт из исследуемого образца разделяют с помощью электрофореза в градиентном (4–16%) додецилсульфат натрия–полиакриламидном геле (SDS–PAGE). Разделённые по молекулярной массе белки путём электрофореза из геля переносят на микропористую нитроцеллюлозную мембрану (блотинг). После чего белки-мишени выявляют с помощью специфических АТ непрямым иммунопероксидазным методом.

Твёрдофазный иммуноферментный анализ

По своему принципу твёрдофазный иммуноферментный анализ ЕLISА (Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay) напоминает вестерн-блотинг, содержание белка-мишени в белковом экстракте определяют с помощью специфических АТ. В ЕLISА используется твёрдая полимерная матрица (96 луночный полистироловый планшет), на которой предварительно иммобилизуются АТ против белка-мишени. Иммобилизация АТ на матрице осуществляется либо путём их ковалентной «пришивки», либо путём их физической адсорбции на твёрдом носителе в результате электростатического и ван-дер-ваальсового взаимодействия.

Конкурентный иммуноферментный анализ. АТ связывают со стенками лунки на полистироловом планшете. Исследуемый материал (например, сыворотка, смыв, белковый экстракт) из исследуемого материала, содержащий искомый белок (антиген, Аг) в неизвестной концентрации, смешивают с определенным количеством меченого белка-мишени и вносят в лунки полистиролового планшета. Аг в белковом экстракте и меченный Аг конкурентно связываются с АТ, фиксированными на стенке лунок. После этого меченный Аг выявляют иммунопероксидазным методом и с помощью специального спектрального прибора определяют активность пероксидазы хрена, которая будет обратно пропорциональна концентрации Аг в исследуемом материале.

Неконкурентный иммуноферментный анализ (метод сэндвича). Первые АТ против белка-мишени иммобилизируют на стенках лунок полистиролового планшета. Затем добавляют исследуемый материал и через определённое время вносят вторые меченные АТ против белка-мишени. Вторые АТ выявляют иммунопероксидазным методом и определяют активность фермента, которая будет линейно зависеть от количества искомого белка в данном образце.

Хромофор-опосредованная лазерная инактивация белков

Излучение лазера на красителях с длиной волны 620 нм фокусируют при помощи оптики микроскопа в виде пятна диаметром 10 мкм. Предварительно ткань обрабатывают АТ, связанными с красителем (хромофором) малахитовым зеленым. АТ избирательно взаимодействуют с белком-мишенью. В результате в непосредственной близости с этим белком оказывается краситель, который аккумулирует энергию лазерного излучения. При этом образуются короткоживущие и повреждающие белок гидроксильные радикалы. Методика позволяет избирательно блокировать функцию конкретных белков в клетке и таким образом устанавливать их роль. При выключении подобным образом функции тех или иных белков оказывается возможным наблюдать поведение клеток в реальном времени. Особенно перспективным представляется использование данного метода для описания функции белков, связанных с цитоскелетом, молекулярными моторами, удлинением частей клетки, образованием их отростков, например, формированием конуса роста аксона, а также роли интегральных и периферических мембранных белков.

МЕТОДЫ ГЕННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ

Генное зондирование позволяет выявить специфические нуклеотидные последовательности ДНК и РНК в исследуемом объекте (биологическая жидкость, биопсия, гистологический срез, мазок). В основе метода лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации по правилу Уотсона–Крика (A-T и G-C), т.е. к комплементарному спариванию нуклеотидов искомой ДНК (или РНК) с олигонуклеотидным зондом, имеющим специфическую последовательность оснований. В состав зонда во время синтеза олигонуклеотида вводят специальную метку (радиоактивные изотопы, флюоресцеины, биотин), позволяющую обнаружить образующиеся двухцепочечные комплексы.

Саузерн-блот (Southern blot)

С помощью ДНК–зонда производят поиск идентичных участков ДНК в исследуемом образце. Пробы ДНК обрабатывают рестрицирующими нуклеазами, а полученные фрагменты ДНК разделяют по размеру (пар нуклеотидов) с помощью электрофореза в агарозном геле. Затем образцы нуклеиновых кислот с геля переносят на нитроцеллюлёзную или нейлоновую мембрану (блотинг), на которой гибридизируют искомую ДНК с ДНК–зондом. Метод визуализации двухцепочечных комплексов зависит от типа метки ДНК–зонда. Положительная реакция гибридизации указывает на присутствие искомого фрагмента ДНК в данном образце.

Нозерн-блот (Northern blot)

Нозерн-блот, в отличие от саузерн-блота, позволяет оценить функциональную активность гена. Метод применяется для обнаружения искомой информационной РНК в исследуемом материале с помощью ДНК– или РНК–зонда. Экстрагированную РНК очищают от «загрязнения» геномной ДНК с помощью дезоксирибонуклеазы (ДНКазы). После электрофоретического разделения РНК в агарозном геле исследуемые образцы переносят на мембрану (как при саузерн-блоте) для гибридизации с олигонуклеотидным зондом и последующей визуализации специфической метки. Положительная или отрицательная реакции гибридизации указывают на включение или выключение экспрессии гена-мишени, соответственно.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) теоретически позволяет обнаружить в пробе всего одну молекулу ДНК. Принцип метода основан на многократном увеличении числа копий искомого участка ДНК, достаточного для достоверной визуализации. Амплификацию (умножение) нуклеотидной последовательности ДНК катализирует ДНК–полимераза. Процесс репликации искомого фрагмента ДНК обуславливают ген-специфические праймеры  ДНК–олигонуклеотиды, каждый из которых комплементарен одной из двух цепей молекулы ДНК (рис. 1-11). Праймеры (20–30 нуклеотидных пар) служат затравками для ДНК–полимеразы при синтезе комплементарной цепи ДНК. Длина амплифицируемого участка синтезируемой ДНК ограничена праймерами и обычно составляет несколько сот пар нуклеотидов. При этом каждая вновь синтезированная цепь ДНК (амплификон) служит матрицей для синтеза новой цепи комплементарной ДНК. Для получения достаточного количества копий искомого фрагмента ДНК требуется от 20 до 30 циклов ПЦР, характеризующихся экспоненциальным увеличением числа копий специфического фрагмента ДНК. Каждый цикл реакции включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах.

 1 этап (денатурация). Нагревание ДНК до 95 °C, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

 2 этап (отжиг). Гибридизация праймеров при 55–60 °C с комплементарными последовательностями на противоположных цепях ДНК (на левой и правой границах амплифицируемого фрагмента).

 3 этап (элонгация). При температуре 68–72 °C праймеры в присутствии ДНК–полимеразы и дезоксирибонуклеотидтрифосфатов служат затравками для синтеза новой цепи ДНК.

Рис. 1-11. Полимеразная цепная реакция. Специфическая пара праймеров служит затравкой для амплификации искомого фрагмента ДНК. Один из праймеров (светлая стрелка) обеспечивает синтез ДНК от правой границы амплифицируемого фрагмента, а второй (чёрная стрелка)  от левой. При этом каждая вновь синтезированная цепь ДНК является матрицей для дальнейшего синтеза ДНК. Поэтому с каждым циклом реакции происходит экспоненциальный рост количества копий искомого фрагмента ДНК. [123]

Процесс амплификации проводится в программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации. Материалом для выявления фрагмента ДНК, специфичного для наследственного или инфекционного заболевания могут служить биопсия, кровь, аспираты, носоглоточные смывы, соскобы из зева, мокрота, моча, эякулят, мазки, спинно-мозговая жидкость, амниотическая жидкость и даже законсервированные (например, парафинизированные) образцы органов и тканей. Для санитарно-эпидемиологического надзора важно то, что для ПЦР доступно исследование проб воды, почвы и образцов пищевых продуктов. В судебной медицине ПЦР позволяет провести идентификацию личности путём генотипирования любого биологического материала, поскольку ДНК сохраняет свою стабильность длительное время (например ДНК, экстрагированная из костной ткани). Генспецифические праймеры создают при помощи компьютерных программ, использующих информацию о нуклеотидной последовательности известных генов микроорганизмов или генов человека, предоставленных на сайтах GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/) и EMBL(www.ebi.ac.uk/embl.html).

Полимеразная цепная реакция в классическом формате. Применяют для выявления локусов предполагаемых мутаций ДНК и ДНК–содержащих микроорганизмов. Из исследуемого материала экстрагируют геномную ДНК, искомый фрагмент которой амплифицируют с помощью ген-специфических праймеров. Конечный результат реакции свидетельствует о присутствии ДНК–мишени в исследуемом материале (например, ДНК вируса гепатита С, мутированный ген супероксиддисмутазы 1 при наследственной форме бокового амиотрофического склероза).

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией. Для выявления специфических участков генома РНК–содержащих вирусов или исследования транскрипции гена-мишени (синтеза информационной РНК) сначала получают ДНК–копию с РНК–матрицы (информационной РНК), используя реакцию обратной транскрипции, катализируемую ферментом ревертазой (обратной транскриптазой). Синтезированные таким образом комплементарные ДНК (кДНК) служат матрицами для ген-специфических праймеров в ПЦР. Положительная ПЦР с праймерами, комплементарными специфической вирусной РНК, доказывает присутствие данного вируса в исследуемом материале. Обнаружение информационной РНК мутированного гена в образце ткани свидетельствует о транскрипции данного гена, т.е. его функциональной активности. Метод позволяет ответить на вопрос, работает или молчит определённый ген.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Показателем уровня экспрессии гена служит концентрация соответствующей информационной РНК. Метод ПЦР в реальном времени даёт возможность не только обнаружить в исследуемой ткани разрешённый к экспрессии ген, но и по динамике изменения концентрации информационной РНК количественно оценить активность этого гена. Из исследуемого материала экстрагируют РНК и с помощью обратной транскриптазы синтезируют комплементарные ДНК. Далее с кДНК–матрицы (реплика информационной РНК) в присутствии ген-специфических праймеров и ДНК–полимеразы выполняют ПЦР. В ходе реакции каждый амплифицируемый фрагмент включает флюоресцентную метку. По характеру включения метки специальные компьютерные программы позволяют определить абсолютное количество молекул мРНК в ткани и таким образом оценить степень функциональной активности гена.

Гибридизация

Гибридизация in situ. В ходе дифференцировки клеток координированно включаются и выключаются большие группы генов. Гибридизация одноцепочечной молекулы ДНК (ДНК–зонд) с комплементарной информационной РНК позволяет ответить на вопрос, присутствует или нет в ткани ген-мишень, происходит или нет экспрессия этого гена, и установить уровень, на котором она может меняться — транскрипция ДНК, сплайсингРНК, трансляция (рис. 1-12). Метод гибридизации in situ позволяет выявить нужные последовательности ДНК или РНК (например, вирусной, бактериальной, грибковой или протозойной в инфицированной ткани). Последовательности нуклеиновых кислот, связанные с меткой (радиоактивный ³²P; биотин, характеризующийся высоким сродством к авидину), находят комплементарную последовательность в клетке. Таким образом, метод гибридизации in situ даёт возможность выявлять гены (рис. 1-12А), изучать их экспрессию и локализовать место трансляции.

Рис. 1-12. Гибридизация in situ. ДНК–зонд связывается с комплементарным участком информационной РНК в исследуемом образце. Визуализация связанного с меткой ДНК–зонда указывает на экспрессию гена-мишени в конкретном клеточном типе. [99]

Рис. 1-12А. Гибридизация in situ. Стрелками указаны участки локализации Y‑хромосомы, ДНК–зонд: ген sry. Свежезамороженный срез.

Матричная гибридизация. Метод основан на технологии гибридизации ген-специфичных олигонуклеотидных ДНК–проб (20–25 нуклеотидов), иммобилизованных в матрицу биологических микрочипов (биочипов), с комплементарной ДНК (кДНК) исследуемого материала. Суммарную РНК экстрагируют из данного материала и с помощью обратной транскриптазы синтезируют кДНК в присутствии флюоресцентной или радиоактивной метки. Результаты гибридизации анализируют с помощью устройств, регистрирующих флюоресценцию или радиоактивность и сопутствующей компьютерной программы. Метод позволяет параллельно анализировать неограниченное число известных генов, поскольку количество иммобилизованных ДНК–проб в биочипе может варьировать от нескольких десятков до нескольких тысяч. В настоящее время доступны биочипы, содержащие десятки тысяч ДНК–проб, синтезированных на основе документированных генов человека. В онкологии практическое применение получили биочипы для диагностики и прогнозирования злокачественных опухолей молочной железы, толстой кишки, предстательной железы, поджелудочной железы, лейкозов, лимфом.

Технологии воздействия на экспрессию гена

Конкретный ген отвечает за определённую функцию. Следовательно, в условиях экспериментального выключения экспрессии гена можно установить его функциональную значимость на уровне клетки, ткани, органа или организма в целом. Современные технологии позволяют остановить экспрессию гена на уровне мРНК без вмешательства в геномную ДНК.

Метод антисмыслового действия

 Антисмысловая одноцепочечная ДНК, обычно длиной 15–25 пар нуклеотидов, комплементарно связывается с мРНК и ингибирует её трансляцию вследствие быстрого разрушения образующихся гибридных ДНК–РНК комплексов РНКазой H. Антисмысловые технологии применяют в генной терапии, где необходимо блокировать трансляцию мРНК–мишени, например при инфекционных (вирусных) и онкологических (лейкемия) заболеваниях.

 Использование антисмысловых РНК (олигонуклеотидов) к различным компонентам цепи передачи митогенного сигнала для подавления их биосинтеза и блокады пролиферации трансформированных клеток считается перспективным подходом к лечению злокачественных опухолей. Уже сконструированы антисмысловые РНК для рецептора эпидермального фактора роста (EGF), трансформирующего фактора роста альфа (TGF) и некоторых других регуляторных молекул.

РНК интерференция  недавно открытый эволюционно консервативный механизм посттранскрипционной блокады синтеза белка. Комплементарное взаимодействие короткой интерферирующей РНК (siRNA) с информационной РНК заканчивается деградацией мРНК–мишени и как следствие прекращением синтеза чужеродного или эндогенного белка. Вызванная деградация мРНК без вмешательства в ядерный геномпризнана мощным экспериментальным инструментом, позволяющим эффективно и высоко избирательно ингибировать синтез белка–мишени в клетках млекопитающих invitro и in vivo. Метод РНК интерференции может быть применён как в исследованиях роли отдельно взятого гена/белка при различных заболеваниях, так и при лечении генетически обусловленных болезней, характеризующихся избыточной экспрессией нормального или мутированного гена.

МАСС-СПЕКТРОСКОПИЯ

Это физический метод исследования структуры вещества, основанный на измерении соотношения массы к заряду частиц вещества. В отличие от других физико-химических методов, определяющих излучение или поглощение энергии молекулами и атомами, масс-спектроскопия непосредственно детектирует сами частицы вещества. Большинство небольших органических молекул при ионизации приобретает только один заряд. Белки, нуклеиновые кислоты и другие полимеры способны приобретать множественные заряды. Чтобы получить масс-спектр необходимо перевести нейтральные молекулы и атомы в ионы, затем перевести ионы в газовую фазу в вакууме. Работа масс-спектрометров, приборов для разделения ионизированных частиц вещества по их массам, основана на воздействии магнитных и электрических полей на пучки ионов, летящих в вакууме. В медицине масс-спектроскопия применяется как метод газового анализа, для диагностики инфицированности человека, например Helicobacter pylori, для определения наличия допинга в крови спортсменов.

ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

Принцип метода состоит в разделении компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна. Жидкостная хроматография как метод была открыта в 1903 году российским учёным Михаилом Цветом. Для разделения растительных пигментов на их составляющие учёный использовал колонки, заполненные порошком мела. Предложенный Цветом метод жидкостной хроматографии был незаслуженно забыт и почти не применялся более 30 лет. В настоящее время существует до 50 различных модификаций этого метода.