Модели болезней человека на животных

Для определения влияния конкретных генов на онтогенетические процессы, их участия в проявлении тех или иных функций широко используют мутантные линии животных, в первую очередь мышей, у которых выявлено несколько сотен мутантных генов. Более того, при помощи методов генной инженерии реализована возможность получения мутанта, дефектного по строго заданному признаку.

ХИМЕРЫ

Химера — мутант, полученный из двух биологических видов. Технология создания химер основана на трансплантации плюрипотентных, полипотентных или унипотентных стволовых клеток от одного вида животного в эмбрион другого. Эта тактика широко применяется в экспериментальной эмбриологии с целью выяснения путей дифференцировки и миграции трансплантированных стволовых клеток в организме реципиента. В результате трансплантации эмбриональных стволовых клеток с введённой чужеродной ДНК в бластоцисту мыши были получены генетически модифицированные трансгенные химеры, экспрессирующие ген (трансген) другого вида млекопитающего.

ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ МЫШИ

Мышь относится к наиболее изученному млекопитающему. На сегодняшний день имеется полная расшифровка генома мыши (30 тыс. генов), который на 80% гомологичен геному человека. Поэтому мыши, полученные с помощью генной инженерии, являются удобной биологической моделью для изучения механизмов патогенеза заболеваний, связанных с мутацией известного гена, а также разработки методов лечения заболевания, вызванного мутацией данного гена (табл. 1-8).

Уровни генетической модификации

Адресная инсерция экзогенной ДНК в ген-мишень. Введение чужеродной ДНК (трансгеноз) основано на рекомбинации между экзогенной чужеродной ДНК и ДНК генома стволовой клетки (генный таргетинг). Подобная рекомбинация позволяет получать наследуемые мутации в любом интересующем гене.

Направленные перестройки в хромосомах (внутрихромосомные, межхромосомные), перенос индивидуальных хромосом или их фрагментов, создание мини-хромосом или искусственных хромосом.

Целый геном. Клонирование с помощью трансплантации ядер.

Получение генетически модифицированных мышей

На первом этапе создают генные конструкции — ретровирусные или плазмидные векторы. Например, к «разрезанной» одноцепочечной РНК ретровируса или к «разрезанной» кольцевой молекуле двухцепочечной ДНК плазмиды добавляют экзогенную ДНК, содержащую, например, мутированный ген человека. На втором этапе полученные векторы трансфецируют в эмбриональные стволовые клетки (трансгеноз). Полученные многочисленные колонии стволовых клеток с помощью ПЦР подвергают скринингу на наличие нужной последовательности ДНК. Инсерция экзогенной ДНК должна произойти в области гена-мишени, т.е. нормальная геномная аллель должна быть замещена мутантной (генный таргетинг). На третьем этапе трансфецированные стволовые клетки, содержащие мутантную аллель гена, инъецируют в бластоцисту. Далее бластоцисту пересаживают в матку приёмной матери. Последующие скрещивания позволяют получить гетеро- или гомозиготных мышей по данному гену. Если экзогенная ДНК присутствует в половых клетках и мыши передают приобретённый ген своему потомству, то выведенные животные с таким устойчивым изменением в геноме называются трансгенными.

 Нокаутные и трансгенные мыши. Методология гомологичной рекомбинации эндогенной и экзогенной ДНК позволяет либо полностью инактивировать ген-мишень в целом организме (knockout, нокаут генов, нокаутные мыши), либо вводить гены с направленными мутациями (knock-in, генный нокин, трансгенные мыши).

 Экспрессирующие векторы. Плазмидные и вирусные векторы конструируют таким образом, что экзогенная ДНК присоединяется к сильному промотору транскрипции. Трансфекция такого вектора в бактерии и дрожжи позволяет получать большие количества рекомбинантных белков (гормон роста, интерферон, иммуноглобулины). Из молока трансгенных козы или коровы, трансфецированных экспрессирующим вектором, можно выделять различные рекомбинантные белки, например лактоферрин.Среди млекопитающих лактоферрин содержится только в молоке женщины и коровье молоко с лактоферрином может успешно заменить женское молоко при искусственном вскармливании.

 Трансгенный человек. Генетическая трансформация плодовых мушек (Drosophila) и животных проводится во многих лабораториях мира. На сегодняшний день рождение генетически модифицированного человека совершенно реально. Но подобные эксперименты недопустимы с моральной точки зрения по причине распространения «искусственных» мутаций в человеческой популяции.

Модели нейродегенеративных болезней человека на мышах

 Болезнь Альцхаймера

 -Амилоидный белок откладывается в головном мозге в виде сенильных бляшек, провоцируя гибель нейронов. Мыши APPSWE (2576) экспрессируют трансген, кодирующий предшественник -амилоидного белка человека. У трансгенных мышей отложение мутантного белка сопровождается дегенерацией нервных клеток и нарушениями памяти, как у человека.

 Мутации пресенилина способствуют образованию амилоидогенных форм -амилоидного белка. Трансгенные мыши Psen1^tm1Tak экспрессируют мутантный белок пресенилин 1 (PS1). У нокаутных мышей Psen2^tm1Ber экспрессия пресенилина 2 (PS2) блокирована.

 Болезнь Шарко–Мари–Тута — одна из форм невропатий — развивается при мутации гена коннексина, кодирующего белок щелевого контакта, что и было выяснено при изучении сходных мутаций у мышей.

 Боковой амиотрофический склероз

 У мышей-гомозигот по гену pmn (progressive motor neuropathy) развивается тяжёлая моторная невропатия. Введение таким мышам цилиарного нейротрофического фактора предупреждало патологическую гибель двигательных нейронов. Этот подход предложен для лечения бокового амиотрофического склероза.

 Мутантные мыши-гомозиготы wobbler по гену wr характеризуются рецессивным наследованием нейродегенеративного заболевания с прогрессирующей гибелью мотонейронов в шейном отделе спинного мозга.

Часть случаев семейной формы заболевания обусловлена доминантными мутациями гена SOD1, кодирующего фермент Cu/Zn супероксиддисмутазу 1. Трансгенные мыши G93A, экспрессирующие мутантный SOD1 (Gly93Ala; глицин замещён на аланин в позиции 93), характеризуются прогрессирующей дегенерацией мотонейронов, как при боковом амиотрофическом склерозе человека.

 Болезнь Хантингтона — наследственное нейродегенеративное заболевание, характеризующееся  прогрессирующей гибелью нервных клеток в базальных ганглиях, особенно в хвостатом ядре и скорлупе. Патогенез заболевания связан с мутацией гена хантингтина HD. Модель заболевания — трансгенные мыши R6/2; мутированный HD содержит >150 повторов CAG кодонов и кодирует аберрантный белок с увеличенным полиглутаминовым треком.

 Спиномозжечковая атаксия. У SCA1 [82Q] мышей избыточная экспрессия мутированного гена ATX1 (атаксин 1), вызывает дегенерацию грушевидных клеток Пуркинье и нейронов ствола мозга. Нормальный белок содержит от 6 до 44 остатков глутамина, аберрантный белок имеет полиглутаминовый трек из 82 остатков глутамина.