§9.9. Генная инженерия. Моноклональные антитела. Гибридомы

Антигены, как указывалось выше (см. с. 667), – чужеродные данному организму белки или полисахариды. Каждый антиген содержит несколько характерных для его детерминантных групп, каждая из которых состоит из аминокислотных остатков или остатков моносахаридов.

Чтобы обезвредить антиген нужно блокировать все детерминантные группы. Блокировка каждой группы осуществляется антителами. Антитела вырабатываются антителообразующими клетками (АОК), которые находятся в основном в лимфатических узлах и селезенке. Каждое антитело может комплементарно связываться только с одной из детерминантных групп антигенов, то есть обладает исключительно высокой специфичностью. Поэтому в ответ на появление в крови антигенов антителообразующие клетки синтезируют целый спектр генетически однородных семейств – клонов антител (от греч. klṓn – ветвь, отпрыск), отличающихся по своей структуре. Сыворотки из антител широко используются для нейтрализации змеиных ядов и бактериальных токсинов.

Однако для решения целого ряда задач в иммунологии необходимо получать в больших количествах однотипные антитела, а не многокомпонентные смеси. Воспроизведение по данному образцу серии идентичных копий (клонов) получило название клонирования.

Георг Кёлер (Германия) и Цезарь Мильштейн (Англия) предложили и разработали для получения моноклональных антител оригинальный метод, основанный на гибридизации нормальной АОК и опухолевой (раковой) клетки. Характерной особенностью раковых опухолей является то, что они возникают из одной генетически измененной (мутантной) клетки. Поэтому опухоли на первой стадии образуют клон идентичных клеток. Эти клетки вырабатывают и секретируют в кровь строго однородные по своим свойствам моноклональные иммуноглобулины, к которым относятся все антитела. Например, раковые клетки опухоли плазмоцитомы – плазмоциты - вырабатывают иммуноглобулины, не отличимые по своей структуре от антител, вырабатываемых нормальными плазматическими клетками.

Другой особенностью раковых клеток является их способность делиться неограниченное число раз.

Можно было ожидать, что гибрид нормальной АОК и близкой по типу дифференцировки опухолевой клетки унаследует от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой – способность к неограниченному делению. Методы гибридизации обычных клеток были достаточно хорошо разработаны. Для этого смесь разнородных клеток обрабатывается полиэтиленгликолем (ПЭГ), который вызывает слияние оболочек разнородных клеток. При этом часть клеток не сливается. Поэтому нужно было решить проблему, как выделить нужные гибридные клетки из смеси неслившихся клеток и гибридных клеток другого состава.

Общая идея селекции заключается в создании таких условий (питательной среды), при которых не нужные клетки погибают а нужные клетки выживают, и могут быть выделены в чистом виде.

Деление клеток (см. гл.VIII, с. 673-693) связано с синтезом в клетках ДНК и РНК. Если подавить каким-либо способом процесс синтеза, то деление клеток станет невозможным, и клетки погибнут. В клетках существует два механизма синтеза ДНК и РНК: основной и резервный. В первом случае в клетке синтезируется необходимый набор нуклеотидов, из которых собираются дочерние молекулы ДНК и РНК. Этот тип синтеза блокируется препаратом аминоптерином (А), который применяется для разрушения опухолей. Во втором случае клетки используют для синтеза ДНК и РНК продукты распада ранее синтезированных нуклеиновых кислот: гипоксантина (Г) и нуклеозида тимидина (Т). Добавление Г и Т в питательную среду снимает токсический эффект А. Поэтому, если блокируется первый механизм, то клетки продолжают делиться, используя второй вариант.

Чтобы подавить деление онкоклеток надо уметь выключать как основной, так и запасной механизм. Так как химическими препаратами сделать это достаточно трудно, то был найден другой способ: путем селекции был получен мутант онкоклетки плазмоцитомы, в котором запасной механизм синтеза был генетически подавлен. Такие клетки погибают в ГАТ – среде, содержащей молекулы гипоксантина (Г), аминоптерина (А) и тимидина (Т). Для этого онкоклетки помещались в питательную среду, к которой добавлялись токсические аналоги Г и Т, то есть молекулы комплементарно идентичные Г и Т, но включающие токсичные элементы или группы атомов. Онкоклетки, которые использовали для синтеза ДНК и РНК токсичные аналоги Г и Т, погибали. Выживало лишь небольшое количество мутантных клеток, которые не могли усваивать Г и Т, так как запасной механизм синтеза был в них подавлен.

Выжившие мутантные онкоклетки выделялись из среды и использовались для гибридизации с нормальными клетками АОК.

Общая схема гибридизации состоит из нескольких этапов, представленных на рис. 9–33.

1. Клетки раковой опухоли плазмоцитомы у мыши инкубировались в питательной среде, содержащей токсичные аналоги Г и Т. Отсеивались выжившие мутантные клетки.

2. Мутантные клетки плазмоцитомы (ПЛ) и нормальные АОК, взятые из лимфатических узлов или селезенки обрабатывались полиэтиленгликолем (ПЭГ). При этом в растворе образовывались комбинации слившихся клеток: [АОК+АОК], [ПЛ+ПЛ], [АОК+ПЛ], а также частично сохранялись одиночные клетки АОК и ПЛ.

3. Затем все клетки отмывались от полиэтиленгликоля (ПЭГ) и инкубировались в питательной среде (ГАТ), содержащей нормальные молекулы гипоксантина (Г), аминоптерина (А) и тимидина (Т). Аминоптерин, как указывалось выше, подавляет основной канал синтеза ДНК и РНК, но нормальные клетки при этом не погибают, так как функционирует резервный канал синтеза. Поэтому нормальные клетки и их гибриды погибали естественной смертью, так как нормальные клетки смертны и могут существовать в питательной среде только несколько дней. Одновременно погибали все клетки мутантной плазмоцитомы и их гибриды, поскольку основной канал синтеза в них подавляется аминоптерином, а резервный канал не работает. Выживали только гибриды [АОК+ПЛ], поскольку бессмертие они унаследовали от клеток плазмоцитомы, а резервный канал – от нормальной АОК-клетки. Гибрид [АОК+ПЛ] получил название гибридом. Гибридомы сохраняют способность синтезировать в питательной среде клоны идентичных антител бесконечно долго.

4. На последнем этапе из отдельных (единичных) гибридом в среде выращивались моноклональные антитела, обладающие предельно высокой специфичностью.

Рис. 9–33. Общая схема гибридизации для получения моноклональных антител (пояснения в тексте)

Моноклональные антитела широко используются в иммунологии, заменяя иммунные сыворотки.

Гибридомные технологии открывают уникальные возможности в диагностике различных заболеваний. Гибридомы позволяют обнаруживать антигены для опухолей определенных тканей и получать соответствующие антитела. Моноклональные антитела могут быть использованы также в качестве высокоспецифичных адресных переносчиков токсических и радиоактивных веществ в опухолевые клетки.

За разработку методов получения моноклональных антител с помощью гибридом Г. Кёлеру и С. Мильштейну в 1984 г. была присуждена Нобелевская премия.