3.8.4. Реакція нейтралізації (рн)

Реакція нейтралізації широко використовується в вірусології: за її допомогою можна виявити нарощування антитіл у сироватці крові людей, що перехворіли, чи імунних організмів, можна ідентифікувати віруси і визначати їх антигенну структуру.

У РН встановлюється здатність імунної сироватки (антитіл) пригнічувати інфекційні властивості вірусу, тобто його здатність до розмноження у чутливих тканинах. Звичайно РН високоспецифічна, тому що імунна сироватка нейтралізує тільки гомологічні штами вірусу. Однак, у сироватках здорових людей і тварин присутні неспецифічні інгібітори, тому доцільно говорити не про віруснейтралізуючі антитіла, а про віруснейтралізуючу активність сироватки, яка у ряді випадків може бути неспецифічною. Тому при постановці РН необхідно ставити відповідні контролі (перевіряти віруснейтралізуючу активність сироватки до імунізації чи у перші дні захворювання, щоб мати можливість правильно оцінювати результати реакції).

Наявність віруснейтралізуючої активності сироваток людей і експериментальних тварин можна виявити у дослідах на тваринах, на курячих ембріонах і в культурі тканини хоріоналантоїсної оболонки курячого ембріону, якщо вони чутливі до досліджуваного вірусу.

У реакції нейтралізації беруть участь 2 компоненти: вірус та сироватка. РН може бути поставлена у двох варіантах: 1) з’єднують рівні об’ємні кількості одного і того же розведення (чи нерозведеної) сироватки зі зростаючими дозами вірусу; чи 2) з’єднують рівні обсяги різних розведень сироватки з постійною дозою вірусу.

Вірус для РН необхідно попередньо відтитрувати, щоб визначити його граничну біологічну активність. Особливо важливо встановити титр вірусу у випадку, коли у реакції використовуються різні розведення сироватки и постійна доза вірусу. Часто при цьому використовують дозу вірусу, рівну 100 чи 1000 LD₅₀.

Віруснейтралізуючі антитіла накопичуються у період одужання (реконвалесценції), але зберігаються тривалий час. Оптимальні терміни для визначення антитіл у кожному випадку різні і залежать від особливостей імунітету при тій чи іншій інфекції. Наприклад, при грипі кількість віруснейтралізуючих антитіл значно наростає до 3-4 тижня і знижується до 6 місяців; при весняному-літньому енцефаліті вони з’являються тільки через 1,5-2 місяці.

Для отримання достовірних діагностичних даних необхідно досліджувати кратні сироватки, що були взяті у гострому періоді і в період одужання. Сироватки можна зберігати у герметично закритому стерильному посуді при 4 ⁰С.

3.9. Реакція гемаглютинації (рга) та реакція гальмування гемаглютинації (ргга)

Гемаглютинація – це феномен склеювання еритроцитів унаслідок дії на них різних біологічних агентів, зокрема й вірусів. Гемаглютинуючі властивості виявлені у багатьох вірусів, патогенних для людини. Ці віруси належати до родів Оrthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Pоxviridae, Reoviridae, Adenoviridae та ін (табл. 14).

Таблиця 14

Умови гемаглютинації деяких вірусів

Вірус		Джерело еритроцитів та умови
Родина	Тип (вид)
Parvoviridae	Підрід А: декілька видів	Людина, морська свинка, миша, 4оС
	Підрід В: адено-асоційований вірус тип 4
Papovaviridae	Вірус поліоми	Морська свинка, 4оС
Adenoviridae	Більшість типів	Мавпа, пацюк, 37оС
Herpesviridae		Немає
Poxviridae	Віруси віспи та вісповакцини	Курка, 37оС
Picornaviridae	Віруси Коксакі (деякі серотипи)	Людина
	Віруси ЕСНО (деякі серотипи)
Togaviridae		Гусак, голуб, суворий контроль рН і температури
Orthomyxoviridae	Віруси грипу типу А і В	Домашній птах, людина, морська свинка, 4оС
Paramyxoviridae	Віруси парагрипу, паротиту	Домашній птах, людина, морська свинка, 4оС
Rhabdovirus	Вірус сказу	Гусак, 4оС
Coronavirus	Коронавіруси	Пацюк, миша, домашній птах, 37оС
Arenavirus		Немає
Reovirus	Типи 1 – 3	Людина

Як правило, гемаглютинуючі властивості збудників вірусних інфекцій забезпечуються їхнім структурним білком, що у простих вірусів (без зовнішньої оболонки) входить до складу капсиду, а у вірусів, які мають суперкапсид, є гліко- або ліпопротеїдом оболонки. Цей білок називають гемаглютиніном. Наявність гемаглютинуючої активності не є показником інфекційних властивостей вірусу.

Наприклад, гемаглютинін вірусу грипу являє собою глікопротеїд, розташований на поверхні віріону у вигляді чисельних коротких виступів. Вірус може прикріплюватися до еритроцитів, що володіють комплементарними рецепторами, створюючи тривимірні структури, що складаються з «склеєних» між собою еритроцитів. Можливо, віруси, адсорбовані на поверхні еритроцитів, змінюють їхній заряд, унаслідок чого еритроцити набувають здатності склеюватися, осідаючи на дно пробірки або лунки планшета тонкою плівкою у вигляді перевернутої парасольки (картина повної гемаглютинації).

Гемаглютинація вірусів грипу, параміксовірусів, ускладнюється тим, що крім гемаглютиніну віріони містять також фермент нейрамінідазу, що руйнує глікопротеїдні рецептори на поверхні еритроцитів, що приводить до десорбції вірусу з поверхні еритроцита. Якщо реакцію проводити при +4^оС (температурі занадто низкій для дії ферменту), то десорбції не відбувається. Для видимої аглютинації курячих еритроцитів (звичайно 0,25 мл 1%-вої суспензії) потрібно близько 10⁷ віріонів вірусу грипу. Отже, реакція гемаглютинації не настільки чутлива, щоб уловити невеликі кількості вірусу, однак вона дуже проста, що робить її зручної при наявності великих кількостей вірусу.

Гемаглютинуючий титр вірусу – це його найбільше розведення, що дає картину повної гемаглютинації. Видову належність аглютинованих еритроцитів нерідко використовують для індикації вірусів. Так, віруси грипу типів А і В аглютинують еритроцити курей, морських свинок, людини з 0 групою крові, а віруси грипу типу С – лише еритроцити курей та людини. Більшість параміксовірусів також аглютинують еритроцити курей, людини і морських свинок, але вірус кору, що до них належить, - лише еритроцити мавп.

Під час постановки РГА доцільніше використовувати еритроцити птахів, а не ссавців, оскільки пташині дають чіткіший результат, швидше осідають і рідко аглютинують спонтанно.

Про специфічність вірусної гемаглютинації роблять висновок за ефектом гальмування або пригнічення її відповідними противірусними антитілами. Це явище знаходиться у основі реакції гальмування гемаглютинації (РГГА). Механізм РГГА полягає в тому, що специфічні противірусні антигемаглютиніни перешкоджають вірусам аглютинувати еритроцити чутливих видів тварин.

РГГА застосовується у вірусології для ідентифікації гемаглютинуючих вірусів, серологічної діагностики вірусних інфекцій (за приростом титру антитіл або за роздільним визначенням Ig), контролю рівня імунітету та масових екологічних досліджень.

РГГА – трикомпонентна серологічна реакція, що крім специфічно взаємодіючих антигену та антитіла має індикатор імунологічної реакції – еритроцити. Реакцію проводять у тих же самих умовах (електролітне середовище, його рН, температура), у тому самому об'ємі і з еритроцитами того самого виду, що й РГА цього вірусного антигену.

Позитивним у РГГА є простота і доступність методики, економічність, можливість визначення в умовах декількох інфекцій (наприклад, при грипі) штамову специфічність гемаглютининів і антитіл до них.

Основним недоліком РГГА є вплив на результат неспецифічних інгібіторів гемаглютинації, що містяться у нормальних сироватках крові людини й тварин.