Полімеразна ланцюгова реакція
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), або метод ампліфікації генів, дає змогу розмножувати задані ланцюжки ДНК у значній препаративній кількості. Вона може бути застосована також для індикації специфічних ДНК у судово-медичному дослідженні, в лабораторній діагностичній практиці, у тому числі в бактеріології та вірусології. Мова іде про індикацію тих нуклеїнових кислот, структура яких вивчена.
В основу ПЛР покладено відкриття ферменту ДНК-полімерази, розробка методу секвенування молекули ДНК, а також синтез олігонуклеотидів різної довжини та специфічності (праймерів).
ДНК-полімераза здатна подовжити короткі олігонуклеотидні затравки (праймери), додаючи до їх 3’-кінця наступний, додатковий, нуклеотид. Для цього необхідний праймер, гібридизований з комплементарним ланцюгом ДНК, яка є матрицею. Як правило, пошук ДНК-матриці і є завданням ПЛР.
Розчин, де відбувається ПЛР, має містити в достатній кількості нуклеотиди, ДНК-полімеразу, специфічні олігонуклеотиди й клінічний матеріал, у вигляді виділеної з нього ДНК. Усі ці компоненти ПЛР утримують в одній пробірці, температурний режим їх послідовно змінюють. Так, у разі діагностики ВІЛ-інфекції:
при 94оС відбувається денатурація досліджуваної ДНК;
при 37 оС до обох розплетених ниток за принципом комплементарності приєднуються затравки (процес “відпалювання праймерів”);
при 72 оС tag-ДНК-полімераза (фермент отримано з термофільних бактерій Thermophylus aguaticus) подовжує праймери до заданого розміру вірусного геному.
Як результат у пробірці замість 2 ниток вірусної ДНК з’являються 4. Цикл повторюють, кількість копій вірусу знову подвоюються і так далі. За 40 циклів ампліфікації кількість копій ДНК збільшується в 1013 разів. Таку кількість ДНК вірусу тепер можна ідентифікувати будь-яким відомим методом (наприклад, за допомогою електрофорезу в поліакріламідному гелі – ПААГ).
Розділ 4. Характеристика типових представників окремих груп вірусів
4.1. Віруси з дволанцюговим ДНК геномом.
4.1.1. Представники родини герпесвірусів та характеристикавикликаних їми хвороб
Н
азва
родини походить від
грецького herpein через латинське
herро - повзати, що повзе. Інфекційні
хвороби, викликані вірусами цієї
родини, протікають гостро, переходять
в латентну стадію, не проявляють себе
до певного часу.
Віріони родини вірусів герпесу мають сферичну форму діаметром від 120 до 300 нм (рис. 28).
Рис 28. Модель та схема будови вірусів гер песу
Усередині зрілої вірусної частки знаходиться 35-45 різних типва білкових молекул.
У центрі віріона розташовано «ядерна зона», розміром 75 нм, що містить ДНК. «Ядро» оточене ікосаедричним капсидом. Розмір капсиду складає 100-110 нм. Капсид побудований з однакових, геометрично правильних, білкових структур - капсомер, в утворенні яких приймають участі протомери. Капсомери точно підібрані і підігнані один до одного, утворюючи ікосаедр. У утворенні капсиду беруть участь шестикутні і п'ятикутні капсомери. Нуклеокапсид містить 162 капсомери : 150 шестикутних (гексамери) і 12 п'ятикутних (пентамери) капсомер. Навколо капсиду є аморфний білковий тегумент і усе це поміщено в оболонку. Через суперкапсидну оболонку вірусів назовні виходять глікопротеїди, що виконують рецепторні функції
Геном Вірусний геном є лінійною дволанцюжковою молекулою ДНК розміром 152261 пар нуклеотидів.У герпесвируса 1 типу людини відсоток ГЦ пар складає 68%, і геном містить 77 кодуючих генів, Геном герпесвируса 2 типу людини є лінійною молекулою ДНК розміром 154746 пар нуклеотидів, відсоток ГЦ пар складає 70%, і несе 77 генів.
Родина герпесвірусів за класифікацією Міжнародного комітету по таксономії вірусів (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) поділяється на підродини. Використовуються критерії:
стриктура геному віруса;
білковий склад;