Глава 2

Методы диагностики Helicobacter pylori

2.1 Методы диагностики Helicobacter pylori :

Среди всего многообразия методов диагностики Helicobаcter pylori выделяют две большие группы – инвазивные и неинвазивыне методы. Инвазивные методы основаны на взятии биоптатов при проведении фиброгастродуоденоскопии(цитологический,гистологический,быстрый уреазный тест). Неинвазивные методы же ,не требуют проведения эндоскопического исследования (уреазный дыхательный тест).Наиболее распространенными из них являются цитологический, уреазный и гистологический методы. [4]

2.1.1-ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ метод:

Материалом для цитологического исследования служат мазки-отпечатки биоптатов, полученные при эндоскопии из участков слизистой оболочки антрального отдела желудка или двенадцатиперстной кишки с наиболее выраженными морфологическими изменениями (гиперемия, отек и т.п.). Мазки высушивают и окрашивают по Романовскому-Гимзе, по Папенгейму или метанолазурэозиновой смесью. При цитологической диагностике можно не только определить наличие возбудителя, но и судить о составе клеточной инфильтрации по наличию лимфоцитов, плазмоцитов, эозинофилов и нейтрофилов. Чувствительность метода колеблется от 90 до 100%, специфичность – 89-100% . [13,14],

2.1.2-ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ методы:

Гистологическое исследование биоптата характеризуется высокой специфичностью - 100%, в случае, если выполняется опытным специалистом. Чувствительность же метода колеблется от 69% до 95%-100%. [14]

Данный метод имеет ряд преимуществ: широкая доступность, удобство хранения и транспортировки препаратов и возможность оценки в любое время любым специалистом, который легко может проводить ретроспективный анализ. Гистологический метод позволяет оценить любую из форм повреждения СОЖ (выраженность воспаления, атрофии, обнаружение метаплазии и дисплазии слизистой). [4,7]

При взятии биопсийных проб возможен ложноотрицательный результат вследствие неоднородности локализации бактерии на слизистой, поэтому для уменьшения вероятности ложноотрицательных результатов рекомендовано взятие двух биоптатов из антрального отдела, двух из тела желудка и одного из угла желудка.[3]

Иммуногистохимический метод

Биопсийный материал, фиксированный в формалине и залитый в парафин, обрабатывается моноклональными антителами против Helicobacter pylori. Готовые к применению коммерческие наборы с моноклональными антителами работают при разведении 1:200000 и избирательно окрашивают только Helicobacter pylori. Этот метод хорошо зарекомендовал себя при исключительно низкой степени обсемененности слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori, когда морфологический метод и уреазный тест дают ложноотрицательные или сомнительные результаты. Он также используется для выявления морфологически измененных (кокковых форм) Helicobacter pylori, ,и даёт возможность не только существенно повысить чувствительность и специфичность гистологического выявления Helicobacter pylori, но и идентифицировать различные штаммы Helicobacter pylori, что важно для выяснения природы повторного инфицирования слизистой оболочки после эффективного антихеликобактерного лечения.[2,14]

2.1.3-УРЕАЗНЫЙ ДЫХАТЕЛЬНЫЙ тест метод ("золотой стандарт" диагностики):

В развитых странах в последние годы стандартным методом контроля за эрадикацией стал уреазный дыхательный тест, который основан на способности уреазы разлагать мочевину до НСО3 ¯ и NH4 +. Из НСО3¯ образуется СО2, который, попадая в кровоток, затем транспортируется в легкие. Для проведения УДТ необходима мочевина, меченная радиоактивным углеродом ¹³С или 14С. Чаще в клинической практике применяется нерадиоакивный стабильный углерод ¹³С. 14С используется реже, так как является источником излучения низкоэнергетических β-частиц, которые обнаруживаются сцинтилляционным счетчиком. Изотоп количественно определяют газовым хроматомасс-спектрометром или с помощью инфракрасного и лазерного оборудования.

В начале исследования берутся 2 фоновые пробы выдыхаемого воздуха. Далее пациент съедает легкий завтрак и тестовый субстрат; в течение 1 часа, с интервалами в 15 минут, у него берут 4 пробы выдыхаемого воздуха. Уровень радиоактивного изотопа в выдыхаемом воздухе определяют в течение 10-30 минут. Затем пробирки направляются на масс-спектрометрию. Результат выражается как приращение ¹³СО2 – δ¹³СО 2, его экскреция (‰) и считается положительной при значениях выше 5‰.[10]

В ряде стран используется определение изотопного отношения концентраций ¹³СО2/¹²СО2, что позволяет свести к минимуму влияние на конечный результат методических и инструментальных погрешностей.

При использовании дыхательного уреазного теста ложноположительные результаты считаются редкими (4-10%), ложноотрицательные результаты возможны у пациентов, принимавших перед исследованием антисекреторные и висмутсодержащие препараты, которые ингибируют уреазу бактерий, в связи с чем рекомендуется осуществлять диагностику эрадикации уреазными методами не ранее чем через месяц после приема этих препаратов,а так же у пациентов имеющих кокковые формы Helicobacter pylori.[10,11]

2.1.4-БЫСТРЫЙ УРЕАЗНЫЙ тест:

Уреазный тест («кампи-тест») относится к числу экспресс-методов выявления Helicobacter pylori.

Стандартный «кампи-тест» состоит из:

•содержащего мочевину геля-носителя

•раствора азида натрия

•раствора фенол-рота - используется в качестве индикатора рН, который при сдвиге рН среды в щелочную сторону меняет свой цвет от желтого к малиновому; сдвиг рН происходит в том случае, если под действием хеликобактерной уреазы происходит гидролиз мочевины с образованием аммиака. В качестве источника хеликобактерной уреазы используют биоптаты слизистой оболочки, которые помещают в луночку специальной плашки из синтетического материала, заполненную готовой стерильной средой. Появление малинового окрашивания теста свидетельствует о наличии в биоптате микробных тел Helicobacter pylori.

О количестве Helicobacter pylori в биоптате косвенно судят по времени изменения окраски теста:

•значительное инфицирование слизистой оболочки НР (+++) - малиновая окраска теста появляется в течение 1 часа от начала исследования

•умеренное инфицирование слизистой оболочки НР (++) - окраска индикатора изменяется через 2–3 часа

•незначительное инфицирование слизистой оболочки НР (+) - малиновое окрашивание теста появляется к концу суток

Более позднее окрашивание теста относят к отрицательным результатам.

При проведении уреазного теста нужно учитывать и тот факт, что он может быть положительным у лиц, желудок которых колонизирован Helicobacter heilmanii, имеющим близкое сродство с Helicobacter pylori.[11,19]

2.1.5-ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ микроскопия:

Helicobacter pylori может быть обнаружен до микробиологического или гистологического исследования при помощи фазово-контрастной микроскопии. Этот метод весьма удобен для обнаружения Helicobacter pylori, при условии достаточно высокой степени обсеменения.[4]

Преимущества фазово-контрастной микроскопии:

•нет необходимости проводить фиксацию материала и дополнительных окрасок ткани

•исследование можно проводить в обычных лабораторных условиях

•результат может быть получен через 1-2 мин.

Микроскопия проводится с увеличением в 100 раз с использованием иммерсионного масла. В препарате - типичные изогнутые бактерии в хаотичном движении.[19]

2.1.6-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ методы:

Иммунологические методы основаны на выявлении у больных, инфицированных Helicobacter pylori, специфических антител, которые можно обнаружить в сыворотке крови уже через 3–4 недели после инфицирования. Достаточно высокий титр антител сохраняется даже в периоде клинической ремиссии заболевания. Отрицательным тест становится после успешного антибактериального лечения, что позволяет использовать метод для контроля эффективности такой терапии. Для выявления специфических антител используют различные методики, в частности, метод иммуноферментного анализа (ИФА) с определением антител IgG и IgA классов в сыворотке крови.

При оценке результатов иммунологического анализа следует помнить, что антитела к различным антигенам бактерии могут присутствовать в крови на протяжении года после эрадикации бактерий, что не позволяет применять методы для контроля результатов антигеликобактерного лечения. [2,10,18]

2.1.7-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ метод:

Наибольшую информацию о Helicobacter pylori возможно получить только при выделении его из прижизненных биопсийных образцов. Это единственный метод исследования, обладающий 100% специфичностью. При этом виде исследования возможно не только выделение чистой культуры Helicobacter pylori и ее идентификация, но и изучение морфологических, биохимических и биологических свойств возбудителя. [14]

Бактериологический метод исследования дает возможность определять антибиотикорезистентность у Helicobacter pylori и проводить за ней динамические наблюдения. Без бактериологического метода планировать клиническое испытание лекарственных препаратов, учитывая причины неудачи эрадикации, нельзя, так как основная причина, снижающая процент эрадикации – антибиотикорезистентность Helicobacter pylori.[13]

В эпидемиологической практике выделение чистой культуры Helicobacter pylori необходимо для внутривидового типирования штаммов, что может быть использовано при мониторинге для дифференциации между реинфекцией новым штаммом и рецидивированием, которое может быть обусловлено тем же штаммом. В научной практике бактериологический метод важен, так как позволяет изучать факторы патогенности Helicobacter pylori, изготовлять препараты для серологической диагностики, создать банк штаммов для эпидемиологических и других исследований, так как штаммы бактерии в замороженном виде при температуре -70°С могут храниться в течение 5-7 лет. [7,13]Без этого метода невозможно дальнейшее научное изучение микроорганизма. Однако этот метод достаточно дорогой. Кроме того, он сопряжен с определенными трудностями, обусловленными необходимостью наличия специальных сред, оптимальной температуры, влажности, качества атмосферного воздуха и т.д. Это приводит к тому, что рост колоний микроорганизмов удается получить далеко не всегда. Неудобство метода связано и с тем, что его результатов приходится ждать, как правило, не менее 10-14дней. В клинической практике он применяется в основном в случаях инфекции Helicobacter pylori, резистентной к обычным схемам антигеликобактерной терапии. Helicobacter pylori крайне «капризен», требует специальных условий культивирования и дорогостоящего оборудования. [10]Большой шаг вперед в успешном культивировании Helicobacter pylori принадлежит транспортным средам, которые дают возможность продлить срок транспортировки биоптата из эндоскопического кабинета в микробиологическую лабораторию до суток (среды Стюарта, Кэри-Блэйера, Био Мерьо).[2]

Посевы инкубируются при температуре 37°С, влажности 98%, в микроаэрофильных условиях в течение 3-10 сут. Helicobacter pylori растет в атмосфере, содержащей 5% кислорода, 5-10% углекислого газа, остальное составляет азот. Для данного микроорганизма губительны как анаэробные условия, так и более высокое содержание кислорода. Для создания микроаэрофильной атмосферы используют газогенераторные пакеты, которые продуцируют газовые смеси после добавления в них воды. Оптимальный рост колоний наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0. Многие штаммы Helicobacter pylori могут расти и развиваться в достаточно широком диапазоне температур при +32°С... +39°С, но не растут при +27°С ...+42°С. Время инкубации: первичное исследование – 7 дней, контроль лечения - 14 дней.[13,20]

На неселективной питательной среде Helicobacter pylori на 3-5 сутки при первичном посеве и на 2 сутки при пересевах чистой культуры формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, росинчатые колонии диаметром 1-3 мм. На селективной питательной среде колонии Helicobacter pylori приобретают характерное золотисто-желтое окрашивание, за счет присутствующего в этой среде трифенилтетразолий хлорида. При появлении колоний, сходных по морфологии с Helicobacter pylori (диаметром до 0,5 – 2 мм в виде «капель росы» или при сплошном росте, образующие прозрачную пленку), происходит их идентификация. Предложена методика полуколичественного определения обсеменения слизистой оболочки желудка в зависимости от числа выросших микробных колоний: до 10 колоний в чашке (1+), 10-20 колоний (2+), 20-50 колоний (3+), более 50 колоний (4+).

Для идентификации мазки окрашивают по Граму. Под микроскопом в случае Helicobacter pylori обнаруживают грамотрицательные изогнутые палочки. Проводят биохимическое типирование – уреазная, каталазная, оксидазная активность, Helicobacter pylori не ферментирует глюкозу, не продуцирует нитраты, не образует индол.[4,10]

2.1.8-ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР):

Метод предназначен для качественного обнаружения ДНК Helicobacter pylori в биологических образцах (биоптаты антрального отдела желудка, биоптаты двенадцатиперстной кишки, биоптаты десен, мазки из зубодесневого кармана, слюна.). Позволяет оценить генотипические и фенотипические характеристики возбудителя. Почти у каждого пациента имеется уникальный штамм Helicobacter pylori. Выявлено, что вирулентность Helicobacter pylori во многом обусловливает клинические проявления инфекции.[7] Существует ряд генов, продукты которых – белки Cag A, Vac A, Ice A, Bab A – полагают факторами патогенности. В зависимости от их наличия выделяют два типа штаммов Helicobacter pylori. Экспрессирующие Cag A- и Vac A-токсин относятся к первому типу, штаммы второго типа не экспрессируют указанные гены и считаются менее патогенными.[22] Среди большого многообразия гибридизационных методов анализа ДНК, метод ПЦР наиболее широко используется в клинической лабораторной диагностике.ПЦР (относится к молекулярно-биологическим методам) представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК-полимеразой.Метод ПЦР в средах позволяет идентифицировать Helicobacter pylori без выделения чистой культуры по присутствующим в исследуемом материале фрагментам его генома.В основе метода ПЦР лежит природный процесс - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний.[7,21]