3.4 Детекция продуктов амплификации:

Разделение продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза

1. Залить в аппарат для электрофореза ТАЕ буфер, приготовленный на дистиллированной воде разбавлением 50хТАЕ в 50 раз.

2. К 2,0 г агарозы добавить 2 мл 50х ТАЕ буфера и 100 мл дистиллированной воды.

3. Приготовленную смесь расплавить на электрической плите или в СВЧ-печи. Добавить к 100 мл расплавленной агарозы 10 мкл 1% раствора бромистого этидия. Перемешать.

4. Охладить расплавленную агарозу до температуры 50-60^оС и залить в планшет для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов установить на планшет гребенку, используя зажим типа «бульдог». После застывания агарозы осторожно вынуть гребенку из геля и перенести планшет с гелем в камеру для проведения электрофореза.

5.Нанести в карманы геля по 10-15 мкл амплификата в последовательности соответствующей нумерации проб. Нанести положительные и отрицательные контроли.

6. Подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и задать напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/См геля. Провести электрофоретическое разделение продуктов амплификации в направлении от катода (-) к аноду (+). Контроль за электрофоретическим разделением осуществляется визуально по движению полосы красителя. Полоса красителя должна пройти от старта 1,5-2см.

Визуализация результатов электрофореза

7. Вынуть гель из формы и перенести его на стекло УФ-трансиллюминатора.

ВНИМАНИЕ! С гелем агарозы следует работать в перчатках. Бромистый этидий является сильным мутагеном.

8. Включить трансиллюминатор и проанализировать результаты анализа. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм.

3.5 Анализ результатов:

1. В отрицательном контрольном образце (К-) полосы должны отсутствовать.

Появление полосы на уровне положительного контроля свидетельствует о контаминации (загрязнении) компонентов набора.

2. В положительных контрольных образцах (К+) должна выявляться одна полоса, соответствующая ПК.

3. Анализируемые пробы:

отсутствие полосы оранжево-красного цвета строго на уровне положительного контроля (ПК) свидетельствует об отсутствии ДНК искомого возбудителя в анализируемой пробе; наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю – о присутствии ДНК искомого возбудителя в анализируемой пробе.

4. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) светофильтра.

Таблица 3.Размер фрагментов ДНК

Н абор	возбудитель	фрагмент ПК, п.н.
ХЕЛИКОПОЛ	Helicobacter pylori	492

Рис.1 Визуализация результатов электрофореза ,при исследовании биопроб на наличие Хеликобактер пилори методом ПЦР.

3.6 Выявление гена CagA h. Pylori

Первое выявление гена CagA H.pylori проводили с использованием коммерческого набора реагентов НПФ «ЛИТЕХ» г. Москва - ХЕЛИКОПОЛ СА .Ниже представлены условия проведения ПЦР выявления генотипа CagA H.pylori с использованием коммерческого набора реагентов

Состав компонентов реакционной смеси для выявления генотипа CagA H.pylori

ХЕЛИКОПОЛ СА:

Вода деионизованная 14,3 мкл

ПЦР-буфер 3 мкл

Раствор дНТФ 3 мкл

MgCl₂ 2,5 мкл

Смесь праймеров cagA 2 мкл

Tag-полимераза (5ед/мкл) .0,2 мкл

Таблица 4.Программа амплификации для выявления генотипа CagA H. pylori

Х ЕЛИКОПОЛ СA, IA, VA
T,оС	время	циклов
94 о	Pause
94 о	1 мин	1
94 о	1 мин	35 для IceAA2 –40
52 о	1 мин
72 о	2 мин
72 о	5 мин	1
10 о	Storage

Проведение ПЦР ( амплификацию) и электрофоретическую детекцию проводили аналогично предыдущему исследованию.[23]

Полученные результаты:

Рис. 2 Детекция ПЦР-продукта методом гель-электрофореза, при определении генотипа CagA H.pylori, с использованием коммерческого набора реагентов НПФ «ЛИТЕХ» г. Москва - ХЕЛИКОПОЛ СА

Вторично проводили выявление генотипа CagA H.pylori характеризующего западный тип при помощи последовательности праймеров взятых нами из открытого источника.

Используемые нами праймеры были синтезированы ОДО «Праймтех» г.Минск, Беларусь. Каждая пара праймеров имела паспорт, где указывались последовательность, концентрация, температура плавления, молекулярный вес, соотношение GC и OD₂₆₀/OD₂₈₀.

Последовательность праймеров для выявления гена CagA H.pylori характеризующего западный тип размером 501 нуклеотидная пара.

CagAWestеrn F

5^/- GGA ACC CTA GTC GGT AAT G 3^/-

CagAWestеrn R

5^/- TTT CAA AGG GAA AGG TCC GCC 3^/-

Состав компонентов реакционной смеси для выявления генотипа CagA H.pylori,характеризующего западный тип из расчета на 1 анализ.

2-х DreamTag PCR Master Miх (DreamTag PCR Green buffer, DreamTag DNA polymerase , 4мМ MgCl₂, Смесь нуклеотидов дНТФ 10 мМ) —12,5 мкл.

Праймер CagA Westеrn F 10 мМ — 1 мкл

Праймер CagA Westеrn R 10 мМ — 1 мкл

Вода деионизованная – 8,5 мкл

Препарат ДНК с концентрацией 20 - 40 нг/мкл - 1мкл

Программа амплификации для выявления генотипа CagA H. pylori характеризующего западный тип

95⁰С пауза

95⁰С 5 мин. 1 цикл

95⁰С 30 сек

55⁰С 30 сек 35 циклов

72⁰С 40 сек

72⁰С 5 мин 1цикл

10⁰С хранение

Проведение ПЦP - исследования

В ПЦР-пробирку вносили 24мкл реакционной смеси, добавляли 1 мкл образца исходной ДНК с концентрацией 20-40нг/мкл и помещали пробирки в амплификатор Palm Cycler фирмы «Corbett Research» (Австралия) для проведения амплификации по соответствующей программе.

Детекция ПЦР-продукта методом гель-электрофореза

Детекцию ПЦР-продуктов проводили в горизонтальной электрофоретической камере типа «Хеликон», Россия, используя 1,7-2% агарозные гели.

Для приготовления агарозных гелей агарозу растворяли в 1,5 M Трис-ЭДТА-боратном буфере c бромистым этидием (0,5мкг/мл) путем нагревания смеси. Затем горячий раствор заливали в специальную камеру и с помощью гребенок формировали лунки. После застывания гель помещали в камеру для проведения электрофореза, содержащую Трис-ЭДТА-боратный буфер и вносили в лунки геля продукты амплификации. После загрузки гелей камеру подключали к источнику питания типа Эльф-4 и устанавливали нужные параметры напряжения и силы тока.

Фотодокументирование результатов проводили видеосканированием в УФ-свете при помощи специальной системы Gel - DосXR «BioRad» (Франция). Величина размера каждой амплифицированной зоны вычислялась относительно электрофоретической подвижности маркеров с известной молекулярной массой GeneRulerTM 100 bp или 50bp DNA Ladder (Fermentas, Литва). [23]

Полученные результаты:

Рис. 3 Детекция ПЦР-продукта методом гель-электрофореза, при определении генотипа CagA H.pylori, с использованием праймеров синтезированнных ОДО «Праймтех» г. Минск, Беларусь.

Таблица 5.Сравнение полученных данных при исследовании на наличие CagА белка, при использовании двух методов(«Праймтех» г. Минск, Беларусь, и НПФ «ЛИТЕХ» г. Москва - ХЕЛИКОПОЛ СА )

№ п\п	CagА ЛИТЕХ.	CagA WEST
	+	+
	-	-
	-	-
	+	+
	+	+
	+	+
	-	-
	+	+
	-	+
	+	+
	-	+
	+	+
	+	+
	-	-
	-	+
	+	+
	-	-
	-	+
	-	-
	-	-
	+	+
	+	-
	-	-
	+	+
	+	+
	-	-
	+	-
	-	+
	+	+
	-	+
	-	-
	-	+
	-	-
	-	-
	-	+
	-	-
	-	+
	-	-
	+	+
	-	+
	-	+
	-	-
	-	-
	-	-

Выводы по полученным результатам:

Из приведенных в таблице данных можно сделать вывод о том что набор «Праймтех» г. Минск, Беларусь,является более специфичным и чувствительным,т.к если сравнивать процентное соотношение отрицательных и положительных результатов в двух наборах(«ЛИТЕХ» :+36,3%,-63,6%;«Праймтех»:+56,8%,-43,1), то количество положительных результатов на наличие CagA белка во втором наборе было выше в 1,5 раза,чем в первом.