2.2. Методика приготовления хромосомных препаратов

Постановка культуры лимфоцитов периферической крови состоит из нескольких этапов (Т.Е. Зерова-Любимова, Н.Г. Горовенко, 2003):

1. На первом этапе разливают во флаконы по 5 мл питательной среды RPMI фирмы ПАНЭКО в 2 флакона на каждого пациента, добавляют во флаконы по 0,5 мл эмбриональной сыворотки и 0,1 мл фитогемагглютинина (ФГА фирмы Sigma), 1 каплю антибиотика, затем добавляют по 0,5 мл крови и осторожно перемешивают. Помещают флаконы в термостат при t+37⁰ C на 72 часа.

2. Второй этап: снятие культуры. На 70 часу культивирования в каждый флакон добавляют по 0,3 мл раствора колхицина (в конечной концентрации 10мк/мл), за 2 – 2,5 часа до снятия культуры. Пробирки центрифугируют в течение 5-7 минут при 1000 об./мин., сливают надосадочную жидкость, хорошо взбалтывают осадок, добавляют 2 мл гипотонического раствора KCl (0,555 мг KCl на 100 мл дистиллированной воды), предварительно подогретого до t+37⁰ C. Затем проводят экспозицию в гипотоническом р-ре – 7 минут; затем снова проводится центрифугирование пробирки в течение 10 минут, сливается надосадочная жидкость, взбалтывается осадок.

3. На третьем этапе проводится фиксация препаратов хромосом. Для этого в пробирку добавляется фиксирующая смесь этанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1 на 30-40 минут, затем центрифугируется в течение 10 минут. Эту процедуру повторяют 3 раза, пока смесь не станет прозрачной.

4. Четвертый этап: раскапывание. Клеточную суспензию раскапывают дозатором (на высоте поднятой вверх руки) на мокрые охлажденные предметные стекла и высушивают над пламенем горелки.

2.4. Метод учета хромосомных аберраций

При выборе метафазных пластинок для анализа хромосом руководствовались общепринятыми критериями, которые включали следующие положения (Н.П. Бочков с соавт., 1972):

1. равномерность разброса хромосом в различных участках пластинки;

2. отсутствие наложений, мешающих идентификации хромосом;

3. средняя степень спирализации хромосом (хромосомы из группы G не в виде точек, а в виде образований с четким определением центромеры, коротких и длинных плеч);

4. все хромосомы одной и той же метафазной пластинки лежат в одном поле зрения при иммерсионном увеличении;

У каждого ребенка анализировали от 20 до 100 метафазных пластинок. Анализ проводили с определением частоты и типов хромосомных аномалий в кариотипе больных.

Учитывали структурные аберрации хроматидного (одиночные фрагменты, делеции), хромосомного (парные фрагменты, кольцевые хромосомы, удлинение центромеры, разрыв по центромере) и геномного (полиплоидные клетки, преждевременное расхождение хроматид, эндоредупликация) типов.

Изучались метафазные пластинки с помощью бинокулярного микроскопа Leica CME (Австрия), окуляр 10х18, объектив 100х, бинокулярная насадка 1,25х.

2.4. Методика проведения рутинного и дифференциального g-окрашивания

Препараты окрашиваются краской Романовского-Гимзы, краску разводят дистиллированной водой в концентрации 1:12. Продолжительность рутинной окраски 8-10 мин. Для уточнения цитогенетических нарушений проводится дифференциальное GTG-окрашивание.

Принцип метода: под влиянием трипсина и фосфатно-солевого буфера окрашивание определяет единую линейную дифференцированность структуры хромосом в метафазе митоза.

Ход проведения окрашивания: Если окрашивание проводится в тот же день, что провели раскапывание культуры, то высушенные на воздухе препараты необходимо выдержать в течение 60 минут в термостате при t +37^o C. Если препараты окрашивать на следующий день, то нужно оставить их при комнатной температуре на ночь и выдержать в течение 25 минут в термостате при t +37^o C. Охладить препараты, затем опустить их на 7-10 секунд в стакан с рабочим р-ром трипсина, который предварительно нагрет до t +22^o C. Перенести препараты, не высушивая, в стакан с р-ром NaCl на 10 сек. Затем опустить препараты в стакан с 1% р-ром красителя Гимзы, приготовленном на фосфатном буфере на 20 минут; отмыть остатки краски в стакане с фосфатным буфером. Высушить препараты с помощью осторожного высушивания фильтровальной бумагой.