Бактериологическое исследование

Классическое бактериологическое исследование - «золотой» стандарт микробиологической диагностики.

Цель бактериологического исследования - выделение чистой культуры возбудителя и ее идентификация.

Алгоритм бактериологического исследования:

• первичная микроскопия исследуемого материала (необязатель­ный этап, в зависимости от характера материала);

• первичный посев с целью выделения чистой культуры;

• накопление чистой культуры;

• изучение комплекса биологических свойств выделенной культуры;

• окончательная идентификация возбудителя.

1-й день исследования

1. Первичная микроскопия

Результат первичной микроскопии дает ориентировочное представление о наличии в клиническом материале различных морфологических форм микроорганизмов, а также позволяет провести их первичную идентификацию по морфолого-тинкториальным свойствам и существить выбор сред для первичного посева.

Гнойное отделяемое — первичная микроскопия обязательна.

Спинномозговая жидкость — первичная микроскопия осадка обязательна.

Мокрота — первичную микроскопию проводят из разведений 10⁴-10⁵.

Мазки из зева и носа — первичную микроскопию не проводят.

Кровь — первичную микроскопию не проводят.

Фекалии — первичную микроскопию не проводят.

2. Первичный посев

Исследуемый материал после первичной микроскопии или без нее (фекалии, моча, мазок из носа и зева, кровь) засевают на соответ­ствующие среды, для выделения чистой культуры:

• сахарный бульон, кровяной агар — для стрептококков;

• желточно-солевой агар, кровяной агар — для стафилококков;

• среда Эндо — для бактерий семейства Enterobacteriaceae;

• МПА (мясо-пептонный агар) — для грамотрицательных бактерий;

• МПА (посев по методу Шукевича) — для выделения протея;

• среда Китта—Тароцци — для выделения анаэробов;

• среда Сабуро — для выделения грибов.

Посев является первым этапом бактериологического исследования (если не проводят первичную микроскопию).

Посев осуществляется следующим образом:

• Посев штрихом с обжигом петли. Материал забирают прокаленной бактериологической петлей и штрихом густо засевают верхнее поле чашки. Далее петлю опять прокаливают и вносят в густо засеянный сектор и проводят 2—3 вертикальные линии по всей чашке. После этого чашку переворачивают, густо засеянный сек­тор остается на нижнем поле чашки. Петлю опять прокаливают, и посев разносят по чашке 2-3 горизонтальными штрихами.

• Посев шпателем. Материал наносят на поверхность среды шпате­лем или пипеткой, а затем шпателем рассеивают по всей поверх­ности.

• Посев тампоном. Для посева тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержи­мое в питательную среду.

• Посев по секторам. При таком посеве дно чашки расчерчивают на секторы, посев проводят штриховыми движениями от края чашки к центру и по секторам.

2-й день исследования

1. Проводят учет роста на питательных средах как однородный или неоднородный.

2. Проводят описание культуральных свойств.

Алгоритм описания колоний

В результате роста на питательной среде образуются колонии (потомки одной клетки). Отбирают изолированные колонии и изуча­ют их — начинается второй этап исследования, направленный на изучение культуральных свойств бактерий. Знания этих свойств необходимы для идентификации полученной чистой культуры, так как каждому виду микроорганизмов при росте на определенной пита­тельной среде соответствуют определенные культуральные свойства.

Колонии изучают:

• макроскопически: невооруженным глазом в проходящем и отра­женном свете;

• микроскопически: при малом увеличении сухой системы микро­скопа.

В проходящем свете изучают:

• величину колоний (крупные, средние, мелкие, карликовые);

• форму колоний (правильная, неправильная, круглая);

• прозрачность колоний (прозрачная, непрозрачная).

В отраженном свете определяют:

• цвет (бесцветные или окрашенные);

• характер поверхности (гладкая, бугристая, блестящая, шерохова­тая);

• высоту колоний над поверхностью среды (вдавленная, плоская, возвышающаяся).

Микроскопически оценивают:

• край (ровный, неровный);

• структуру (гомогенная, негомогенная).

Изучение колоний заканчивается приготовлением мазка, окраской его по методу Грама и микроскопией.

При взятии материала из колонии для приготовления мазка оцени­вают ее консистенцию (мягкая, слизистая, сухая).

Если при микроскопии культура оказалась чистая, то ее пересева­ют на скошенный агар для накопления.

3-й день исследования

1. Описание характера роста на скошенном агаре:

• однородный, неоднородный;

• по штриху, сплошной, сливной.

2. Проверка чистоты накопленной культуры. Готовят мазки, окра­шивают по Граму и микроскопируют. Если накоплена чистая культу­ра, то она подвергается дальнейшей идентификации. Идентификация бактерий до рода и вида основана на изучении особенностей мета­болизма — биохимическая идентификация и антигенного строения — серологическая идентификация.

3. Изучение биохимических свойств. Биохимические свойства — способность бактерий расщеплять те или иные субстраты за счет продукции соответствующих ферментов. Для изучения биохимиче­ских свойств используют дифференциально-диагностические среды, содержащие различные субстраты (пестрый ряд). В их состав входят среды Гисса с углеводами, лакмусовое молоко, желатин, среды с ами­нокислотами, МПБ (мясо-пептонный бульон) с индикаторами на сероводород и индол.

• Сахаролитические свойства изучают на средах Гисса. В их состав входят пептонная вода, субстрат-углевод (различные моно- и полисахариды), многоатомные спирты и индикатор.

Если у бактерий есть ферменты, расщепляющие субстрат-углевод, то они выделяют продукты метаболизма (кислоту или кислоту и газ). При кислотообразовании индикатор меняет цвет среды, при газообразовании регистрируют разрывы среды.

• Протеолитические свойства изучают при посеве на желатин и лакмусовое молоко. Если у бактерий есть протеазы, то желатин разжижается. В молоке появляется сгусток кремового цвета, а над ним жидкость — пептонизация молока (за счет того, что протеазы бактерий расщепляют казеин молока до пептона).

• Пептолитические свойства. Чаще бактерии способны расщеплять промежуточные продукты распада белков — пептоны. Продукты этого процесса: амины (скатол, индол), аминокислоты, газы (сероводород, аммиак, углекислый газ). Их можно обнаружить с помощью индикаторной бумаги:

• лакмусовая — для выявления аммиака;

• смоченная щавелевоуксусной кислотой — для выявления индола;

• смоченная ацетатом свинца — для выявления сероводорода. Продукты дезаминирования и декарбоксилирования аминокислот обнаруживают с помощью тест-полос, изменяющих свой цвет при изменении рН среды.

4-й день исследования

1. Проводят учет результатов биохимических тестов. После того как культура идентифицирована до вида, у нее изучают ряд дополнитель­ных признаков, таких как чувствительность к антибиотикам, токсигенность, наличие факторов вирулентности, плазмидный профиль, а также проводят внутривидовую дифференцировку.

2. Результаты биохимической идентификации служат основанием для проведения серологической идентификации. Серологическую идентификацию выделенной культуры проводят в реакции агглю­тинации на стекле с помощью соответствующих иммунных адсор­бированных сывороток, выбор которых определяется результатами биохимической идентификации.

Внутривидовая дифференциация — определение принадлежности штамма к тому или иному фаговару, бактериоциногеновару, бактериоциновару, биовару, резистовару и т.д. Она позволяет выявить эпи­демиологические связи между штаммами одного вида.

Идентификация выделенной культуры позволяет сделать заклю­чение о том, какой микроорганизм служит этиологическим фактором заболевания. При выделении условно-патогенных бактерий необхо­димо соблюдать критерии этиологической значимости:

• присутствие бактерий в материале из патологического очага в количестве не менее 10⁵ КОЕ мл /г;

• повторное выделение из материала той же культуры;

• нарастания титра Ат в сыворотке крови больного к аутоштамму в 4 раза и более.

Определение фаговаров бактерий (фаготипирование)

Определение фаговаров проводят по эпидемиологическим пока­заниям для установления эпидемиологических связей между забо­левшими. Для проведения исследования берут чашки Петри с МПА, подсушивают поверхность, расчерчивают дно на квадраты и марки­руют. Далее 3-4-часовую культуру в бульоне засевают газоном, под­сушивают и на каждый квадрат наносят каплю соответствующего типового фага в рабочем разведении. Посевы помещают в термостат на сутки. Через 24ч учитывают спектр чувствительности культуры к определенным фагам по литическому действию.

определение бактериоциновара

Для определения бактериоциновара определяют чувствительность исследуемых штаммов к эталонным бактериоциноварам. Как и фаго- типирование, его проводят по эпидпоказаниям.

Для проведения исследования соответствующие стандартные культуры-продуценты типовых бактериоцинов засевают на питательные среды. Посевы помещают в термостат при 37 °С на 48 ч.

Выросшие колонии индикаторных культур инактивируют хлоро­формом, после чего на поверхность наливают 2—4 мл расплавленного агара, в который предварительно вносят 0,2 мл исследуемой 4-часовой бульонной культуры. После того как агар застыл, посевы вновь поме­щают в термостат на 18—24 ч. Через указанное время учитывают нали­чие зон задержки роста вокруг индикаторных культур, тем самым определяют бактериоциновар изучаемых бактерий.

Тест-системы для идентификации бактерий

На современном этапе для биохимической идентификации микро­организмов используют готовые тест-системы. Коммерческие тест- системы — это готовые полистироловые планшеты с сухими дифферен­циальными средами или субстратами. Одни из наиболее востребован­ных — микротесты фирмы Плива—Лахема (производства Чехии).

В практических лабораториях широко используют диагностиче­ские системы API, производства фирм «bioMerieux» (Франция), «Becton Dickinson» и «Micro Scan» (США), идентификатор микроорганизмов «MicroTax» производства компании «SY-LAB» (Австрия). С помощью тест-систем, выпускаемых этими фирмами, идентификация бактерий приводится в течение 3—48 ч. В нашей стране лабораториям предложе­ны выпускаемые Ставропольской государственной академией систе­мы для биохимической идентификации энтеробактерий (ММТ-Е1 и ММТ-Е2), коринебактерий (ММТ-Д) и ММТ-В для идентификации вибрионов.

В Нижнем Новгороде НИИЭМ «Диагностические системы» выпу­скает СИБ-системы индикаторных полос и одноразовых диагности­ческих пластин для идентификации энтеробактерий и стафилокок­ков. Выпускают тест-системы для идентификации энтеробактерий МТС-М-12Е (НПО «Питательные среды», г. Махачкала).

Этапы идентификации микроорганизмов в тест-системах:

1-й этап: выделение чистой культуры;

2-й этап: подготовка бактериальной суспензии;

3-й этап: инокуляция культуры в лунки планшета;

4-й этап: оценка результатов;

5-й этап: идентификация культуры.

Данные этапы выполняют в соответствии с инструкцией произво­дителя.