Реакция лизиса

Реакция иммунного лизиса. Реакция основана на том, что Ат-лизины способны растворять микроорганизмы только в присутствии комплемента. Для проведе­ния реакции готовят ряд разведений инактивированной нагреванием сыворотки, затем добавляют взвесь микроорганизмов и комплемент. Всё инкубируют. После инкубации в термостате проводят оценку результатов с помощью высевов с количественным учетом. Для кон­троля используют исследуемую культуру микроорганизмов, нормаль­ную сыворотку и комплемент.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) — сложная, многокомпо­нентная реакция, состоящая из двух систем:

• первая система (тест-система): Аг+Ат+комплемент, где Аг или Ат — неизвестный компонент;

• вторая система (индикаторная, или гемолитическая, система): эритроциты барана + гемолитическая сыворотка.

Если на первом этапе реакции произошло специфическое взаимо­действие Аг и Ат, то комплемент адсорбируется на образовавшемся комплексе. Процесс связывания комплемента визуально не прояв­ляется. В связи с этим используют вторую индикаторную систему — гемолитическую, состоящую из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки (гемолитическую сыворотку получают при иммунизации кролика эритроцитами барана). Эта индикаторная система высоко­чувствительна к свободному комплементу. В его присутствии проис­ходит иммунный гемолиз.

В зависимости от присутствия обнаруживаемых Аг или Ат возмож­но два исхода.

• Если на первом этапе образовался комплекс Аг-Ат, то на нем адсорбируется комплемент. При добавлении гемолитической системы гемолиза не происходит, так как комплемента в свободном состоянии не осталось. (Все компоненты реакции берутся в строго определенных рабочих дозах.)

• Если в исследуемой сыворотке комплекс Аг—Ат не образовался, то комплемент остался в свободном состоянии, и он адсорбируется на комплексе гемолитической системы. Визуально это проявляется в лизисе эритроцитов и образовании «лаковой» крови.

Перед постановкой РСК все компоненты, участвующие в реакции, титруют.

Титр гемолитической сыворотки — ее наибольшее разведение, кото­рое вызывает полный гемолиз эритроцитов в течение 1 ч при 37 °С.

Рабочая доза гемолитической сыворотки равна тройному ее титру.

Титр комплемента — наименьшее его количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов.

Рабочая доза комплемента — в основном опыте РСК (в объеме 0,5 мл) должна быть выше титра на 20—30%.

Тктр антигена — минимальная доза, не вызывающая задержку гемолиза.

Для РСК используют рабочую дозу Аг = 1/2 ее титра.

Реакции иммунитета с использованием метки

Реакция иммунофлюоресценции

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) основана на использова­нии флюорохромов, химически связанных с Ат. При этом меченные люминесцентной меткой Ат вступают во взаимодействие с корпускулярным Аг. Образовавшиеся специфические комплексы обнаружива­ют по интенсивному свечению, регистрируемому с помощью люми­несцентного микроскопа. Существуют разновидности этой реакции.

При постановке прямой РИФ используют противомикробные флюо­ресцирующие Ат, т.е. реакция происходит против возбудителя.

Непрямая РИФ (РНИФ) проходит в два этапа. На первом этапе используют обычные антисыворотки к анализируемому возбудителю. Образовавшиеся при этом комплексы Аг-Ат на втором этапе выявля­ют с помощью люминесцентной сыворотки, которая содержит мече­ные Ат против иммуноглобулина того вида животного, сыворотка которого использована на первом этапе реакции.

Иммуноферментный анализ

Метод основан на использовании меченных ферментом сыворо­ток. Индикацию образовавшихся комплексов проводят по химиче­ской реакции между ферментом и субстратом, сопровождающейся изменением цвета. Интенсивность окраски хромогена соответствует количеству образовавшихся комплексов Аг и меченных ферментом Ат. В качестве фермента чаще всего бывает пероксидаза или щелоч­ная фосфатаза. Для проведения анализа используют твердофазный носитель с сорбированным Аг или Ат. Реакцию можно ставить для обнаружения как Аг, так и Ат.

Основные этапы реакции по обнаружению Ат:

• Сорбция известного Аг в лунке планшета.

• Внесение исследуемой сыворотки; промывка.

• Внесение меченной ферментом антиглобулиновой сыворотки; промывка.

• Внесение хромогенного субстрата.

• Регистрация реакции.

Основные этапы реакции по обнаружению Аг:

• Сорбция известного Ат в лунке планшета.

• Внесение Аг содержащего материала; промывка.

• Внесение Ат той же специфичности, но другого вида животного.

• Внесение меченной ферментом сыворотки против иммуногло­булинов того вида животного, сыворотка которого была использована последней; промывка.

• Внесение хромогенного субстрата.

• Регистрация реакции.

Радиоиммунный метод

В основе радиоиммунного анализа (РИА) лежит использование Ат, меченных радиоактивной меткой. Материал, в котором ищут неиз­вестный Аг, обрабатывают такой сывороткой. Если в исследуемом материале есть соответствующий Аг, образуется комплекс Аг—Ат, обладающий радиоактивностью, которую легко выявить с помощью специального счетчика. Если соответствующих Аг в исследуемом материале нет, то меченные радиоактивной меткой Ат не связываются и легко удаляются на этапе промывания. Как и реакция иммунофлюоресценции, радиоиммунный анализ может быть проведен в прямом и непрямом вариантах для обнаружения Аг