Молекулярно-генетические методы исследования

ДНК-гибридизация

Различают две методики гибридизации:

• гибридизация, проводимая в растворе;

• гибридизация, проводимая на твердой поверхности.

Гибридизация в растворе

При реализации этого метода искомая нуклеиновая кислота и зонд взаимодействуют в водной реакционной смеси, что повышает ско­рость процесса гибридизации.

Метод ДНК-гибридизации основан на способности денатуриро­ванной одноцепочечной ДНК достраивать гомологичную цепь в бес­клеточной системе. В качестве материала для второй цепи используют ДНК-зонды (коммерчески производимые фрагменты молекулы известной ДНК, гомологичные фрагментам искомой ДНК возбудите­ля, меченные радиоактивным изотопом или ферментом).

При наличии в исследуемом материале гомологичных участков ДНК по закону комплементарности ДНК-зонд взаимодействует с ним.

Учет результатов проводят по уровню радиоактивности или при добавлении к пробе субстрата, который соответствует используемому в зонде ферменту. Образование специфического комплекса субстрат-фермент означает, что в исследуемом материале есть ДНК, соответ­ствующая ДНК-зонду.

Гибридизация на твердом носителе (блот-гибридизация)

Основана на ДНК-гибридизации зонда на твердой поверхности, в качестве которой используют полимерный мембранный фильтр. Основные этапы исследования:

• исследуемый образец обрабатывают ультразвуком для получения коротких фрагментов находящихся в нем ДНК;

• проводят денатурацию нуклеиновой кислоты;

• денатурированные нуклеиновые кислоты наносят на мембран­ный фильтр и фиксируют;

• проводят предварительную гибридизацию со специальным буфе­ром при 65 °С;

• добавляют гибридизационный буфер, который содержит денату­рированный зонд, и проводят гибридизацию при 65 °С.

«Сэндвич»-гибридизация

Этот метод предполагает использование двух видов ДНК-зондов, которые гомологичны различным участкам искомой нуклеиновой кис­лоты. Чтобы связать искомую нуклеиновую кислоту, присутствующую в исследуемом образце, один зонд фиксируют на мембране. После окон­чания процесса гибридизации мембрану отмывают от исследуемого мате­риала и добавляют раствор, который содержит второй зонд, несущий метку. После этого процесс гибридизации повторяют, при этом мече­ный зонд взаимодействует с искомым участком нуклеиновой кислоты. Окончательная детекция зависит от характера меток, которые могут быть ферментно-гибридизационными, флюоресцентными, хемилюминесцентными и т.д.

Гибридизация in situ

Процесс гибридизации проводят непосредственно на срезе или в мазке с использованием зондов. Основу метода составляет прин­цип твердофазной гибридизации или гибридизации в растворе. Используемый в реакции зонд содержит флюоресцентную метку. После окончания процесса гибридизации связавшиеся молекулы в исследуемом мазке или срезе выявляют под флюоресцентным микроскопом. При данном методе возможен количественный ана­лиз.

Полимеразная цепная реакция

Принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) основан на естественной репликации ДНК, которая включает денатурацию спирали ДНК, расхождение нитей и комплементарный синтез новых нитей ДНК. ПЦР обеспечивает амплификацию фрагментов генома и быстрое накопление определенной последовательности ДНК. В резуль­тате получают большое количество ДНК, которое достаточно для про­ведения анализа различными методами детекции.

Для реакции используют набор праймеров фрагментов ДНК, которые являются маркерами данного возбудителя. При добавлении такого праймера к пробе исследуемого материала, содержащей дена­турированную одноцепочечную ДНК возбудителя, происходит их соединение с комплементарным участком ДНК. Образовавшиеся двунитевые фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, и так повторяется много раз, поэтому реакция носит цепной характер. За 2-3 ч происходит 30-40 циклов амплификации, что приводит к образованию большого коли­чества соответствующих копий нуклеотидных последовательностей, которое можно зарегистрировать.

Компоненты реакции:

• Праймеры-олигонуклеотиды, состоящие из 15-30 нуклеотидов, комплементарных участкам на идентифицируемой матричной ДНК.

• Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов — строительный материал, используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

• Taq-полимераза, обладающая ДНК-полимеразной активностью.

• Буферный раствор, катализатор фермента Taq-ДНК-полимеразы.

• Исследуемый образец — препарат, который служит мишенью для последующей амплификации.

ДНК-чипы

Технология ДНК-чипов основана на гибридизации нуклеотидной последовательности исследуемого материала с известными ДНК-последовательностями, расположенными в определенном порядке, иммобилизованными на поверхности стекла или кремня. Результат реакции детектируют по флюоресценции зонда, предварительно меченного флюорохромом и гибридизированного с одной из иммобилизированных проб.

Биочип — матрица, состоящая из ячеек. В каждой ячейке закре­плен олигонуклеотид (последовательность из нескольких нуклеино­вых кислот). Каждый нуклеотид имеет одинаковую длину и отлича­ется от другого последовательностью аминокислот.

Исследуемый образец наносят на все ячейки чипа, а затем через некоторое время сливают. Если имеется нуклеотид комплементарный шкрепленному в ячейке, то между ними образуется связь, и после нромывания они не удаляются. Затем образец исследуют под флюо­ресцентным микроскопом, который регистрирует результат образования комплекса по световому сигналу. Светящиеся ячейки кодируют олигонуклеотиды исходной пробы. Таким образом, зная нуклеотиды, которые были изначально помещены в данной ячейке, можно сделать нывод о составе фрагмента исследуемой ДНК.

15