7.Комплемент, пути активации, функции. Значение в противоинфекционной защите. Методы определений активности и показатели.

Система комплемента - совокупность белков сыворотки крови, связанных каскадом последовательной активности при их взаимодействии с комплексом антиген-антитело - (классический путь), либо со структурами полисахаридной природы (альтернативный путь).

Состав: Компоненты: С1, С2, С3 …С9 (всего 11 белков, компонент С1 – 3 белка: q, r, s), Факторы B, D, H, I, P, Регуляторные белки: С1-ингибитор, С3в-инактиватор, Рецепторы белков комплемента (на клетках)- CR1-CR4.

Активация: Процесс расщепления белка на 2 фрагмента (а и в) либо изменение его конформации, в результате чего белок приобретает способность активировать последующий белок системы. Протекает каскадно.

Классическая система комплемента состоит из 9 компонентов (от CI до С9) и 3 регулирующих гомеостаз системы белков (ингибитора CI эстеразы, инактиватора СЗб и инактиватора С6). Третий компонент (СЗ) является центральным белком всей системы и его количество в сыворотке составляет примерно 75% всей массы белков комлемента. Протекает в иммунном организме. Активатор – иммунный комплекс (антиген-антитело).

Альтернативный путь активации протекает в неиммунном организме (без участия комплекса антиген-антитело). Основные активаторы – бактериальные продукты (ЛПС). Не участвуют ранние белки (С1, С4, С2). Участвуют факторы B, D, P и поздние белки (С3, С5-С9).

Лектиновый путь. Активатор – маннозо-связывающий белок (лектин) – аналог C1q, связывается с углеводами поверхности микробов. Как классический, начиная с активации С4.

Синтез белков комплемента осуществляется клетками системы мононуклеарных фагоцитов, фибластов, печенью. У человека встречаются генетические дефекты по большинству компонентов комплемента. Клинически они проявляются в форме синдрома системной красной волчанки, рецидивирующих пиогенных инфекций, ангионевротическим отеком. Данные о функциональной активности белков комплемента и их концентрации дают очень важную информацию о протекании заболевания, могут быть использованы для оценки тяжести течения, эффективности терапевтических мероприятий, прогноза заболевания.

Функции: Лизис мембран бактерий (бактериолиз). Цитолиз (лизис соматических клеток) – в цитотоксических и аутоиммунных реакциях. Нейтрализация вирусов – С1, С4, С2. Хемотаксическая активность для фагоцитов – С5а, С3а. Опсонизация объектов фагоцитоза (С3в). Анафилатоксическая активность (С3а, С5а) – индукция воспаления: адсорбция на рецепторах тучных клеток и базофилах, индукция их дегрануляции, прямое воздействие на ГМЦ и повышение проницаемости сосудов, активация фагоцитов в выбросу лизосомальных ферментов. Иммунорегуляция (С3а, С5а) – активация и ингибиция Т-лимфоцитов при взаимодействии с рецепторами.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ КООМПЛИМЕНТА:

1. Определение общей гемолитической активности классического пути. Сыворотку крови разводят физиологическим раствором 1:10 и вносят в пробирки в объеме от 0,05 до. 0,5 мл. Объем проб доводят до 1,5 мл физиологическим раствором и вносят по 1,5 мл гемолитической системы (смесь равных объемов 3% взвесей бараньих эритроцитов и гемолитической сыворотки). Пробирки инкубируют при 37°С 45 минут,- охлаждают при 4°С для остановки реакции и центрифугируют при 1500 оборотов 4-5 минут. После центрифугирования определяют объем сыворотки, вызывающий лизис 50% сенсибилизированных эритроцитов (условную гемолитическую единицу активности комлемента - СН 50), затем рассчитывают количество СН 50 на мл цельной сыворотки. У здоровых людей титр комлемента (СН 50 на мл) составляет примерно 40-60 СН 50.

Гемолитическую активность альтернативного пути комплемента определяют также, но вместо сенсибилизированных бараньих эритроцитов используют несенсибилизированные кроличьи эритроциты и физиологический раствор, содержащий ионы Mg, но без Са для блокирования классического пути активации.

2.Определение функциональной активности отдельных компонентов. Этот метод позволяет определить численность функционально активных молекул в I мл сыворотки крови. Для этого к сенсибилизированным эритроцитам добавляют реагент на определенный компонент комплемента (в качестве реагента используют либо смесь компонентов комлемента, исключая искомый, либо сывоттку крови, лишенную активности этого компонента. Сыворотку для титрования компонентов классического пути разводят в 40-50 -раз, а альтернативного - в 5-7 раз. Таким образом можно уста­новить дефект определенных компонентов и определить профиль комплемента при различных заболеваниях.

3. Иммунохимическое определение концентрации компонентов комплемента. Данный метод исследования позволяет определить концентрацию каждого из белков комплемента, используя антисыворотки (антитела) к ним. Концентрация белков выражается в г\л.

4. Определение активности комплемента и его компонентов методом радиального гемолиза в агаровом геле. Гемолитическую систему смешивают с расплавленным агаром в соотношении 1:7 и быстро выли­вают в стерильные чашки Петри. После застывания в агаре проделывают лунки диаметром 4 мм (до 15 лунок на 1-ой чашке). Лунки заполняются испытуемыми сыворотками и помещают чашки в холодильник при 4°С на 21 час для диффузии белков комплемента в агар. Затем чашки помещают в термостат на 1 час для проявления зон гемолиза. Критерием активности комплемента служит

квадрат диаметра зон гемолиза.

8. Фагоцитоз. Фагоциты. Стадии фагоцитоза. Механизмы внутриклеточного бактерицидного действия. Исходы (завершённый, незавершенный фагоцитоз). Хемотаксины, опсонины, происхождение и роль в противоинфекционном иммунитете.

Фагоцитоз - процесс захвата и биодеградации чужеродных частиц и макромолекул специализированными клетками иммунной системы. Стадии: 1. Хемотаксис и миграция фагоцитов в очаг воспаления 2. Адгезия и захват объекта фагоцитом 3. Образование фагосомы, а затем – фаголизосомы 4. Умерщвление микроба (механизм внутриклеточной бактерицидности) 5. Переваривание компонентов микроба 6. Исход (завершенный или незавершенный фагоцитоз).

Фагоциты: 1. Гранулоциты 2. Моноциты (макрофаги) Моноциты циркулируют в крови несколько часов, а затем уходят в органы, где превращаются в тканевые макрофаги (в печени – в клетки Купфера; в почках – мезангиальные клетки; в легких – альвеолярные макрофаги и др.). 3. Дендритные клетки. Профессиональные антигенпрезентирующие клетки, осуществляют связь между врожденным и приобретенным иммунитетом, принадлежат к миелоидному ряду, к ним относятся клетки Лангерганса (кожа), интердигитальные клетки (лимфоузлы), ДК тимуса, слизистых.

Механизмы бактерицидности фагоцитов: Образование токсических продуктов кислорода (с участием и без участия миелопероксидазы), Азотистые метаболиты (NO, радикал NO-), Активные субстанции , в т.ч. ферменты (лизоцим), Локальное закисление.

Опсонины - белки, усиливающие фагоцитоз: IgG, белки острой фазы (С-реакгивный протеин, маннансвязывающий лектин); липополисахаридсвязывающий протеин, компоненты комплемента -СЗЬ, С4Ь; сурфактантные протеины легких SP-A, SP-D.

Моноциты составляют 5-10 %, а нейтрофилы 60-70 % лейкоцитов крови. Поступая в ткань моноциты формируют популяцию тканевых макрофагов: купферовские клетки (или звездчатые ретикулоэндотелиоциты печени), микроглия ЦНС, остеокласты костной ткани, альвеолярные и интерстициальные макрофаги. Фагоциты направленно перемещаются к объекту фагоцитоза, реагируя на хемоатграктанты: вещества микробов, активированные компоненты комплемемента (С5а, СЗа) и цитокины. Плазмалемма фагоцита обхватывает бактерии или другие корпускулы и собственные поврежденные клетки. Затем объект фагоцитоза окружается плазмалеммой и мембранная везикула (фагосома), погружается в цитоплазму фагоцита. Мембрана фагосомы сливается с лизосомой, рН закисляется до 4,5; активируются ферменты лизосомы. Фагоцитированный микроб разрушается под действием ферментов лизосом, катионных белков дефензинов, катепсина G, лизоцима и др. факторов. При окислительном (дыхательном) взрыве в фагоците образуются токсичные антимикробные формы кислорода - перекись водорода Н202, супероксиданион 02-, гидроксильный радикал ОН-, синглетный кислород. Кроме этого антимикробным действием обладают окись азота и радикал NO-.

Фагоцитоз может быть завершенным, завершающимся гибелью захваченного микроба, и незавершенным, при котором микробы не погибают (гибель фагоцита, равновесие между фагоцитом и объектом (персистенция)). Примером незавершенного фагоцитоза является фагоцитоз гонококков, туберкулезных палочек и лейшманий.