130. Банки генов и клонотеки

Банк генов (gene bank) — набор генов данного организма, полученныйна основе рекомбинантных ДНК.

Библиотека генов (gene library) — коллекция произвольно клонированных фрагментов геномной ДНК организма или специальный набор фрагментов ДНК, представляющих, напр., коллекцию иРНК (см. РНК информационная, кДНК), экспрессирующуюся в клетке в

определенное время. В таких библиотеках фрагменты инсерцируются (включаются) в подходящие вектора, напр, космидные (см. Космида) или бакте-риальные векторы, и трансформируются (см. Трансформация) в подходящего хозяина. В идеале геномная библиотека должна содержать практически весь геном вида, из которого она происходит, а библиотека кДНК — все различные молекулы иРНК данной клетки на одной и той же стадии развития. Сейчас сконструировано множество типов генных библиотек для различных целей исследования.

Геномная библиотека (genomic library) — набор клонированных фрагментов ДНК, представляющих индивидуальный (видовой) геном. У млекопитающих (в т. ч. у человека)

геномы крупные, поэтому для них обычно создают хромосомные библиотеки.

Возможность проведения шотганэкспериментов рассматривалась еще тогда, когда технология рекомбинантных ДНК делала свои первые шаги. Идея амплификации очень сложных смесей фрагментов ДНК и последующего обнаружения одного из них казалась фантастичной, а сейчас она представляется почти банальной. Основной принцип этого подхода состоит в создании коллекции рекомбинантных молекул, составляющих полный геном данного организма (библиотеки рекомбинантных молекул).

По существу, полный нефракционированный набор фрагментов ДНК превращают в соответствующий набор стабильных рекомбинантов, который можно сохранять и многократно использовать для клонирования различных вставок.

При этом применяются Е. соli-системы хозяин-вектор, где в качестве вектора используются плазмиды или бактериофаги, поскольку они более пригодны для получения большого числа рекомбинантных молекул и удобны для хранения.

Наиболее важны два типа библиотек. Одна из них, создаваемая из суммарной геномной ДНК, в принципе должна содержать все гены данного организма. Однако такая цель обычно оказывается недостижимой, поскольку некоторые последовательности ДНК не удается клонировать. Один из вариантов геномной библиотеки представляет собой всю ДНК какой-то одной хромосомы. Для создания такой библиотеки необходимо выделить ДНК из отдельных хромосом. Хромосомы человека фракционируют с помощью методов, аналогичных используемым при сортировке флуоресцирующих и нефлуоресцирующих клеток.

Библиотеки второго типа включают последовательности, составляющие всю мРНК, обнаруживаемую в определенных клетках. В этом случае популяцию мРНК превращают в популяцию молекул кДНК, которые затем клонируют. Геномные библиотеки представляют собой собрание генов и последовательностей ДНК; в библиотеках кДНК представлены продукты экспрессии этих генов в форме мРНК.

а. Геномные библиотеки

Геномные библиотеки обычно создают с помощью векторов, сконструированных на основе бактериофага λ или космиды.

Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.

Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.

В составе векторов, можно клонировать фрагменты ДНКразмером до 23 тпн, что обусловило их исполь-

зование при создании так называемых библио-тек генов, или клонотек (геномных библиотек).

Для формирования библиотеки генов какого-либо организма в векторные ДНК встраивают полученные случайным образом крупные фраг-менты изучаемого генома. Расщепление препа-рата высокомолекулярной ДНК на большие вза-

имно перекрывающиеся фрагменты осуществ-ляют чаще всего путем частичного гидролиза мелкощепящей рестриктазой. Фрагментация также возможна с по-мощью физических методов. Для избавления от неспецифического фона (встройка в вектор двухили более несоседних на геноме фрагментов)гидролизат ДНК подвергают фракционирова-нию по размеру и в реакцию лигирования вво-дят фрагменты протяженностью 15-20 тпн,с тем чтобы в векторную ДНК фага Я мог встроиться только один фрагмент. При встройке двухи более фрагментов размер гибридной ДНК бу-дет превышать предельно допустимый. Важнымсвойством этой экспериментальной системы является то, что при упаковке в капсид in vitroпроисходит отбор гибридных молекул фаговойДНК определенного размера (от 38 до 51 тпн).

Другой подход предполагает дефосфорилиро-вание фрагментированной геномной ДНК с кон-цов с помощью фосфатазы. Такие фрагменты не способны лигироваться между собой, но встраи-ваются в векторную ДНК, имеющую нормаль-ные фосфорилированные 5'-концы. В этом слу-чае нет необходимости во фракционированиипрепарата клонируемой ДНК по размерам.При создании библиотеки генов определен-ного организма важно, чтобы каждый сегментизучаемого генома был представлен среди гиб-ридных молекул ДНК. Необходимое количест-во клонов в библиотеке определяется соотно-шением размера генома и среднего размеравставок по формулеизучаемой хромосоме. Последовательно выяв-ляя «соседей», клоны гибридов можно иденти-фицировать и расположить в таком порядке, что-бы их вставки в целом последовательно покры-вали весь геном. Такой набор клонов называют энциклопедией генов. -Космидные библиотеки генов состоят из меньшего числа клонов, чем библиотеки на ос-нове векторных фагов Я . Однако последние все же предпочтительнее в тех случа-ях, когда не требуются фрагменты размером бо-лее 20 тпн.