148. Особенности организации векторных систем для экспрессии генов.(

Для введения в клетки бактерий чужеродных ДНК необходимо наличие так называемого клонирующего вектора, т.е. автономно реплицирующегося в клетках фрагмента ДНК. Большая часть известных векторов сконструирована ан основе имеющихся в клетках бактерий внехромосомальных элементов типа плазмид или бактериофагов. При их создании и использовании придерживаются следующих критериев:

• вектор должен быть небольшим в связи с тем, что эффективность трансформации клеток-хозяев снижается по мере увеличения размера плазмиды до 15 тыс. пар нуклеотидов (т.п.н.) и выше;

• вектор должен быть хорошо охарактеризован относительно числа генов и их расположения, а также сайтов рестрикции и нуклеотидной последовательности;

• вектор должен легко реплицироваться в клетке-хозяине;

• вектор должен иметь один или несколько селективных маркеров (генов), позволяющих легко отличать клетки, несущие вектор, от нетрансформированных клеток;

• идеальный вектор должен дополнительно содержать маркер, который может быть активирован или инактивирован путем встраивания фрагментов гетерологичной ДНК;

• вектор должен содержать максимальное число уникальных сайтов рестрикции, в которые может быть осуществлена вставка гетерологичной ДНК.

149. Сложная структура организации эукариотических генов и их экспрессия в прокариотических клетках.

У эукариотических организмов механизм регуляции транскрипции гораздо более сложен. В результате клонирования и секвенирования генов эукариот обнаружены специфические последовательности, принимающие участие в транскрипции и трансляции.

Для эукариотической клетки характерно:

1. Наличие интронов и экзонов в молекуле ДНК.

2. Созревание и-РНК - вырезание интронов и сшивка экзонов.

3. Наличие регуляторных элементов, регулирующих транскрипцию, таких как:

а) промоторы - 3 вида, на каждый из которых садится специфическая полимераза. Pol I реплицирует рибосомные гены, Pol II - структурные гены белков, Pol III - гены, кодирующие небольшие РНК. Промотор Pol I и Pol II находятся перед участком инициации транскрипции, промотор Pol III - в рамках структурного гена;

б) модуляторы - последовательности ДНК, усиливающие уровень транскрипции;

в) усилители - последовательности, усиливающие уровень транскрипции и действующие независимо от своего положения относительно кодирующей части гена и состояния начальной точки синтеза РНК;

г) терминаторы - специфические последовательности, прекращающие и трансляцию, и транскрипцию.

Эти последовательности по своей первичной структуре и расположению относительно инициирующего кодона отличаются от прокариотических, и бактериальная РНК-полимераза их не "узнает". Таким образом, для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены находились под контролем прокариотических регуляторных элементов. Это обстоятельство необходимо учитывать при конструировании векторов для экспрессии.

Что касается экспрессии генов эукариот бактериях, то она происходит крайне редко, если не создаваТ специальные условия, поскольку регуляторные участки эукариот отличны от таковых у бактерий. Регуляторные (сигнальные) участк не узнаются бактериальными РНК-полимеразами, что привода к замедлению транскрипции. При клонировании геномной ДНГ<, эукариотической клетки экспрессия генов не происходит изч отсутствия у бактерий системы сплайсинга. Следовательно, д! экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот необх| димо, чтобы данные гены находились под контролем прокари^ тических регуляторных элементов. В связи с этим для осуществл ния экспрессии эукариотического гена соответствующая кДЙ (или синтетическая ДНК), содержащая кодирующую последов тельность, в составе векторной молекулы (например, плазмида присоединяется к регуляторным элементам бактери и - промотор оператору и рибосом-связывающему участку.