III. Методы окрашивания гистологических препаратов

Различают несколько типов гистологического окрашивания: прогрессивное и регрессивное, прямое и непрямое, простое и сложное, обзорное и специальное.

При прогрессивном окрашивании срез сразу же приобретает нужную степень (тон) окраски. При регрессивной окраске красители окрашивают срез более интенсивно, чем это необходимо, перекрашивают его. Такие перекрашенные срезы затем обрабатывают особым веществом, которое ослабляет (дифференцирует) окраску до желаемого тона. Применение регрессивных методов окраски требует определенного навыка, который приобретается постепенно.

Прямое окрашивание - окрашивание объекта непосредственно в растворе красителя, непрямое (протравное) – срез окрашивают нужным красителем лишь после предварительной обработки специальными протравными красителями.

При простом окрашивании применяют один краситель. Сложное окрашивание предусматривает обработку препарата несколькими красителями одновременно или последовательно.

Обзорные методы используются для получения общего ориентировочного представления об изучаемом объекте (окрашиваются преимущественно ядра и каким–то контрастным красителем цитоплазма клеток). Специальные позволяют окрашивать именно те тканевые клеточные элементы, которые интересуют исследователя (органеллы, волокнистые структуры и др.). Методы, составляющие вторую группу, более сложные и требуют особых способов фиксации.

IV. Общие правила окрашивания гистологических препаратов

Для того, чтобы получить хорошие результаты при любом методе окраски гистологических препаратов, необходимо соблюдать определенные правила:

1. Красящие растворы должны быть чистыми, поэтому любой краситель необходимо перед употреблением отфильтровать, а водный раствор красителя готовить только на дистиллированной воде;

2. Отдавать предпочтение окрашиванию красителями низкой концентрации в течении длительного времени перед кратковременной окраской красителями высокой концентрации;

3. Отдавать предпочтение регрессивным методам, но тщательно контролировать степень ослабления окраски отмывающей жидкостью - дифференцировку;

4. Тщательно удалять отмывающую жидкость при окрашивании регрессивными методами (в противном случае она будет продолжать действовать и обесцветит срез);

5. Предпочтительно применять тонкие срезы, т.к. толстые затрудняют дифференцировку и приводят к неравномерной окраске ткани;

6. Окраску проводить под контролем микроскопа при слабом увеличении (просматривать отмытые срезы в капле воды без покровного стекла);

7. Тщательно выполнять все процедуры при подготовке среза к окраске и последующей его обработке. Так, при выявлении жира нельзя для фиксации пользоваться спиртом – он растворяет жир. Фиксация осмием ухудшает окраску ядер;

8. Чаще сначала окрашивают ядра, а потом цитоплазму;

9. Перед перенесением во второй краситель, как правило, срез отмывают от предыдущего красителя, пока от него не перестанет отходить облако предыдущего красителя.

10. Нужно помнить, что если применяются водные растворы красителей, то и последней средой перед крашением должна быть вода, а если применяются спиртовые растворы красителей, то срезы перед крашением должны пропитываться спиртом одноименной концентрации.

Окраске подвергают как наклеенные на стекла, так и свободно плавающие срезы. В первом случае употребляют биологические стаканчики, высокие бюксы, специальные кюветы.

Чтобы увеличить пропускную способность, стекла со срезами складывают попарно спинками друг к другу и располагают в виде треугольника или (в более просторном сосуде) укладывают пары друг за другом разделяя их с помощью различных приспособлений (изогнутых стеклянных или металлических пластинок). Для работы со свободноплавающими срезами применяют часовые стекла, низкие бюксы или чашечки. Стекла со срезами переносят из бюкса в бюкс с помощью пинцета, свободноплавающие срезы – с помощью стеклянного (или металлического) крючка или шпателя.

При переносе срезов из одного раствора в другой необходимо следить за тем, чтобы последующая порция жидкости как можно меньше загрязнялась предыдущей. Для этого при переносе предметных стекол и свободноплавающих срезов необходимо обеспечить максимальное стекание жидкости, следя одновременно за тем, чтобы срез не подсох (высыхание заметно по побелению среза). Предметные стекла, сложенные попарно, необходимо разъединить и быстро просушить обратную сторону фильтровальной бумагой или тряпочкой, следя за тем, чтобы не перепутались стороны. Следует также быть внимательным при опускании и извлечении стекол со срезами, ибо при этом можно поцарапать срезы.

Для окрашивания срезов, наклеенных на стекла, можно применять кюветы или специальные металлические стойки, позволяющие одновременно окрашивать большое количество (до 40-50) стекол, а также применять окрашивание накапыванием красителя на срез. Для окрашивания накапыванием в плоские чашечки или ванночки кладут параллельно стеклянные палочки, на которые укладывают предметные стекла. Для того, чтобы палочки не смещались, концы их соединяют резиновой трубкой. После этого на срез с помощью пипетки накапывают раствор красителя. Если окрашивание длительное, то во избежание испарения красителя место расположения среза накрывают часовым стеклом. Подобный эффект можно получить, поместив предметные стекла с накапанным красителем в чашечку Петри, одновременно положив рядом смоченную в воде вату.

Посуда должна быть четко этикетирована и расставлена в определенном порядке обеспечивающем нужную последовательность работы. Необходимо своевременно менять растворы, не допуская их чрезмерного загрязнения.