VI. Обзорные методы окрашивания

Для обзорных целей в гистологической практике чаще всего употребляют гематоксилин – эозиновую окраску. Этот метод отлично выявляет все клеточные элементы и некоторые неклеточные структуры, поэтому применяется практически во всех случаях, независимо от поставленной цели. Даже в тех случаях, когда пользуются специальными методами крашения, ряд срезов параллельно окрашивают гематоксилин – эозином. К обзорным (общим) методам окрашивания также относится: окраска железным гематоксилином по методу Гейденгайна и окраска соком черники или аронии.

Окраска гематоксилин - эозином является двойной: гематоксилин – основной краситель - окрашивает ядра клеток, эозин – кислый краситель – красит цитоплазму клеток и в меньшей степени – различные неклеточные структуры.

Гематоксилин (C₁₆H₁₄O₆) является экстрактом из кампешевого дерева, произрастающего в Америке. Имеет вид буроватого кристаллического порошка, хорошо растворимого в спирте, глицерине и плохо в воде (по этой причине срезы, окрашенные гематоксилином нельзя заключать в глицерин).

Красящим веществом является не сам гематоксилин, а продукт его окисления – гематеин (C₁₆H₁₂O₆), поэтому многие гематоксилиновые краски пригодны для работы после «созревания», в течение которого происходит окисление гематоксилина в гематеин (созревания требуют только те гематоксилиновые краски, которые готовят без окислителей). В продаже есть и готовый гематеин; приготовляемые из него красящиеся растворы не требуют созревания. Гематоксилин (гематеин) дает окрашивание только при применении протрав, с которыми он образует солеобразные соединения - лаки. Протравами является соли хрома, железа, меди, алюминия.

Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина (Эрлиха, Майера, Вейгерта, Бемера и т.д.). Одним из лучших и наиболее распространенных является квасцовый гематоксилин Эрлиха, который окрашивает ядра в синий цвет. Для его приготовления 2 г. гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют в 100 мл. дистиллированной воды, 100 мл. глицерина, 3г. калийных квасцов (алюмокалиевых) 10 мл. ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Калийные квасцы должны быть химически чистыми. Полученный раствор наливают в широкогорлую банку, завязывают марлей и в таком виде выдерживают на свету при доступе воздуха в течение 15 дней и более. В начале красящий раствор имеет светло-коричневый (светло - красный) цвет, а по мере созревания становится темно-вишневым и приобретает приятный запах; при этом краска значительно усыхает. Для ускорения созревания раствор время от времени взбалтывают. Созревший раствор может долго храниться в банках с притертыми пробками. Можно сразу растворить 0,5г сухого гематеина в 100 мл. 96% спирта, а затем добавить остальные вещества. Тогда не надо проводить «дозревание».

Эозин – искусственный цитоплазматический краситель, растворимый в воде и спиртах. Существует в виде многих сортов. Является тетробромпроизводным флуоресцина и выделяется в виде натриевой, калиевой или аммониевой соли. Окрашивает цитоплазму клеток в розовый цвет, который хорошо контрастирует с синей окраской ядер гематоксилином Эрлиха. Само название этой краски произошло от греческого слова «эос» – заря.

Для приготовления эозина 0,1г красителя растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Можно использовать и 0,25 – 05% спиртовые растворы эозина, для приготовления которых берут спирты различной крепости (40 до 70⁰); они окрашивают сильнее водных. Если ткани плохо воспринимают обычный (не подкисленный) эозин, его подкисляют уксусной кислотой, примерно из расчета 1 капля 3% уксусной кислоты на 100 мл раствора эозина. Подкислять лучше спиртовые растворы, ибо подкисленные водные с течением времени могут мутнеть и давать осадки.

Для окрашивания гематоксилин - эозином парафиновые и целлоидиновые срезы специальной подготовки не требуют т.к. перед заливкой обезжиривались в спиртах. Замороженные срезы помещают в спирт на 3-5 минут, затем переносят в воду (срезы при этом обезжириваются и лучше красятся). Прогрессивным методом окраску проводят сначала гематоксилином Эрлиха. Из воды срезы переносят в раствор красителя (в бюксы, на часовое стекло) или капают краситель на предметное стекло. Созревший краситель дает хорошие результаты через 2-3 мин (не более 5 мин). Однако продолжительность окраски зависит не только от самого красителя, но и от объекта. Поэтому на первых срезах определяют продолжительность окраски под контролем микроскопа, а затем строго выдерживают её. Если окраска удачная, ядра клеток имеют интенсивную красновато - фиолетовую окраску, в них хорошо видны ядрышки и глыбки хроматина, цитоплазма не окрашена. При слабой окрашенности ядер в светло – фиолетовый цвет без четкого различия микроструктур – время окрашивания увеличивают. При черной окраске ядер с красноватым оттенком, расплывчатыми структурными элементами и окрашенной цитоплазмой время крашения уменьшают.

Установив оптимальное время окрашивания, срезы красят гематоксилином, а затем в течении 3-5 мин отмывают излишки красителя в дистиллированной воде. После этого подсинивают ядра, помещая срезы в щелочную среду. Наиболее употребляемой щелочной средой является водопроводная вода из-за наличия в ней щелочноземельных металлов. Препараты выдерживают в водопроводной воде 10 – 15 минут и больше, пока красновато – фиолетовая окраска ядер сменится на синюю, а затем промывают дистиллированной водой 3-5 минут.

Если желают получить резко синие ядра, воду искусственно подщелачивают нашатырным спиртом (10 и 25%) из расчёта 3-5 капель на 0,5л. воды. В искусственно подщелоченной воде срезы синеют очень быстро, но требуют, затем более длительного отмывания от щёлочи в дистиллированной воде, иначе срезы плохо воспринимают эозин. В связи с этим следует избегать сильного подщелачивания воды.

Помимо изложенного выше прогрессивного метода окраски ядер гематоксилином, существует регрессивный метод. Ядра сначала перекрашивают (5 – 20 минут), затем промывают в дистиллированной воде и дифференцируют (ослабляют) 1-2 с в подкисленном 70% спирте (5-6 капель крепкой соляной кислоты на 100 мл спирта, что соответствует 1% раствору HCI в 70% спирте), и под контролем микроскопа следят за ослаблением окраски (ослабевает фиолетовый и усиливается красноватый тон ядер). Дальнейшая обработка обычная.

Гематоксилин Эрлиха (особенно давно приготовленный и, следовательно, значительно созревший) относится к сильным гематоксилиновым красителям. По этой причине, даже при прогрессивном методе окрашивания, он красит не только ядра, но и закрашивает цитоплазму, которая при последующем наслаивании эозина даст фиолетовый фон (вместо розового). Поэтому при желании иметь совершенно четкие и контрастные препараты их практически всегда дифференцируют (ослабляют) в солянокислом спирте, извлекая избытки гематоксилина с ядер и полностью удаляя его из цитоплазмы клеток.

При такой окраске с дифференцировкой препараты получаются более контрастными и яркими, синие ядра резко выделяются на совершено чистом розовом фоне.

Для усиления красящих свойств гематоксилина Эрлиха его можно подогреть до 37⁰.

По окончании промывки окрашенного гематоксилином препарата в дистиллированной воде его вновь извлекают, удаляют излишнюю влагу и помещают в раствор эозина на 0,5 -2-3 мин (продолжительность окраски определяют под контролем микроскопа) т.к. точную экспозицию трудно указать из-за разнообразия сортов эозина. При удачной окраске срез имеет равномерный желто – розовый цвет, на фоне которого выделяются синие ядра. Если цитоплазма имеет едва заметный розоватый или желтоватый оттенок – препарат недокрашен и требует увеличения времени окрашивания. А если общий фон интенсивно красного цвета, микроструктуры видны нечетко, границы ядер расплывчаты - препарат перекрашен и требует уменьшения времени экспозиции.

После того, как окрашивание эозином закончено, красители сливают обратно во флаконы (их можно употреблять многократно), препарат ополаскивают в дистиллированной воде 1 минуту, обезвоживают в спиртах восходящей концентрации, просветляют в карбол – ксилоле, обрабатывают ксилолом и заключают в бальзам или полистирол. Следует помнить, что эозин легко вымывается в воде и спиртах низкой концентрации, поэтому проводить препарат через эти жидкости следует быстро, лишь окунув несколько раз, и только в 96% и 100% спирте можно держать 1-2 мин. Если препарат перекрашен эозином, то излишнюю окраску следует удалить, увеличив время промывания (в дистиллированной воде) и проведения через слабые спирты. Лучше иметь недоокрашенный эозином препарат , чем перекрашенный.

Описанный двойной метод обзорной окраски препаратов гематоксилином Эрлиха – эозином является наиболее распространенным методом окрашивания ядер и фона – цитоплазмы и различных неклеточных структур. Существует много других ядерных и фоновых красок, которые в сочетании дают принципиально те же результаты. Гематоксилин Эрлиха может быть заменен гематоксилином, приготовленным по другим рецептам (гематоксилином Вейгерта, Майера и др.). Ядра можно окрасить также метиленовым синим, кармином и др. В качестве фоновой окраски можно взять оранжевый G, окрашивающий цитоплазму в светло-оранжевый, светло – зелёный цвет; пикриновую кислоту (после окраски ядер кармином), окрашивающую – цитоплазму и эритроциты в жёлтый цвет. Комбинации красителей зависят от конкретных задач, поставленных пред исследователем.

Схема окраски гематоксилин – эозином в общем выглядит так:

Прогрессивный метод

1. Гематоксилин Эрлиха 2-5 мин. (регрессивный метод 5-10 мин.)

2. Д истиллированная вода 3-5 мин

3. Д ифференцировка в 1% солянокислом спирте 1-2 сек.

4. Дистиллированная вода

5. Водопроводная вода 10-15 мин. (или дистиллированная с несколькими капельками аммиака)

6. Дистиллированная вода 3-5 мин.

7. Раствор эозина 1% водный 0,5-3 мин (5 раз обмакнуть)

8. Дистиллированная вода 1 мин.