1.1.1. Липиды мембран

Липиды (греч.lipos - жир) – группа природных веществ, нераст- воримых в воде, но растворимых в неполярных растворителях (хлороформе, эфире и т.д.). Молекулы липидов являются амфифильными, то есть, каждая молекула липида имеет гидрофильную (растворимую в воде) «головку» и два гидрофобных (нераствори­мых в воде) «хвоста» (рис.6,А). Молекулы «хвоста» представляют собой длинную углеводородную цепь.

В состав мембран входят липиды следующих классов: фосфолипиды, сфинголипиды, гликолипиды, стероиды (рис.6,Б). У большинства эука- риотических клеток они составляют 30-70% массы мембран.

Рис.6. Схемы молекулы мембранного липида (А) и мембранных

липидов разных классов (Б) (Из: Мушкамбаров, 2004)

Фосфолипиды (рис.7) – относятся к производным фосфатидной кислоты и являются основным классом липидов мембран; составляют 50-90% от общего числа липидов. В состав «головки» входят остатки азотистого основания (холин, коламин, серин), фосфатная группа и глицерин, с которым связаны остатки двух жирных кислот цепей «хвоста»: олеиновой и пальмитиновой. Из мембранных фосфолипидов вы­свобождается под действием фосфолипазы А арахидоновая кислота, являющаяся предшест- венником биологически активных и гормоноподобных веществ, участвующих в передаче сигналов как медиаторы, вазоактивные факторы, вторичные посредники. Из арахидиновой кислоты (С₂₀ - полиненасыщенная жирная кислота) об­разуются эйкозаноиды: простагландины, тромбоксаны, лейкотриены, которые участвуют (табл.2):

1 - в развитии аномальных воспалительных процессов (ревматоид- ный артрит) и псореаза;

2 – в возникновении болевых и температурных реакций;

3 - в образовании тромбов;

4 - в регуляции сокращения матки;

5 – в механизмах ссужения бронхов и др.;

6 – в регуляции цикла сна и бодрствования;

7 - в расширении сосудов и регуляции артериального давления.

Р ис.7. Формулы фосфатидной кислоты и некоторых её производных (Из: Северцев, 2007)

В мембранах клеток представлено большое количество разных видов фосфолипидов (табл.3), распределенных неравномерно по разным клеточным мембранам (табл.4).

Фосфатидилхолины (лецитин) (рис.7,8) являются важнейшими из фосфолипидов и составляет 50% от суммы всех фосфолипидов мембран. Им принадлежит главная роль в образовании мембран и липопротеинов; они является предшественниками арахидоновой клетки.

Фосфатидилсерины служат регуляторами активности многих ферментов, локализованных на мембранах клеток.

Фосфатидилинозитолы (рис.7) – содержат в своем составе вместо азотсодержащей группы остаток инозита (шестиатомный циклический спирт). В мембранах их содержание достигает 10%. Липиды этого семейства непосредственно учавствуют в передаче некоторых сигналов клетку.

Таблица 2

Свойства наиболее важных эйказаноидов (Из: Фаллер, Шилдс, 2004)

Таблица 3

Основные липиды биологических мембран. Процент содер-

жания рассчитан от общего количества липидов в мембране

(Из: Фаллер, Шилдс, 2004)

Основные липиды мембран	Заряд головной группы	Процент содержания (диапазон)
Фосфоглицериды	0 до -2	50-90%
Фосфатидилхолин	0	40-60%
Фосфатидилэтаноламин	0	20-30%
Фосфатидилсерин	-1	5-15%
Кардиолипин	-2	0-20%
Фосфатидилинозитол	-1	5-10%
Сфингомиелин	0	5-20%
Холестерол	0	0-10%

Таблица 4

Разнообразие мембран по химическому составу её составляющих

(Из: Фаллер, Шилдс, 2004)

Кардиолипины – липиды, образующиеся из двух молекул фосфатидной кислоты (фосфолипид без азотистого основания), связанных друг с другом через глицерин. Кардиолипины имеют 4 углеводородных «хвоста» и более объемную «головку» (рис.7,9). Содержание кардиолипинов в мембранах митохондрий достигает 20% от всех фосфолипидов.

Рис.8. Модель молекулы

фосфатидилхолина

Рис.9. Схема структуры молекулы кардиолипинов

Сфинголипиды (рис.7) - второй основной тип липидов мембран, у которых вместо глицерина и одной цепи «хвоста» имеется сфингозин (двухатомный аминоспирт). Типичный представитель сфинголипидов – сфингомиелин (рис.10), который является основой миелина, окружающего и изолирующего нервные волокна, входит в состав мембран эритроцитов, клеток почек и других тканей.

Рис.10. Модель молекулы сфингомиелина (Из : Страйер,1985)

Гликолипиды (рис.7,11) - подсемейство сфинголипидов; отличаются от сфинголипидов тем, что вместо остатка азотистого основания и фосфатной группы входит углевод: если углевод простой (глюко­за), то образуется группа цереброзидов, если сложный – ганглиозиды (рис.12). Жирные кислоты «хвоста» - нервоновая или цереброновая. Цереброзиды входят в состав мембран нейронов.

Ганглиозиды:

1 - являются специфическими рецепторами для раз­личных молекул;

2 - выступают как специфические детерминаторы межклеточного взаимодействия, так как иг­рают важную роль в процессах роста и дифференцировки ткани;

3 - определяют различие между антигенами групп крови А и В;

4 - нарушение обмена ганглиозидов приводит к аутосомно-рецессивному заболеванию – ганглиозидозу;

5 - накопление ганглиозидов, связанное с неспособностью клетки рас- щеплять их, приводит к возникновению заболеваний – мукополисахаридозов (табл.5).

Рис.11. Формула гликоли- пидов: цереброзида и ганглиозида (Из : Страй -ер,1985)

Нарушение обмена сфинголипидов и их подсемейств вызывает целый ряд заболеваний, связан­ных с развитием умственной отсталости, патологии нервов, дегенерацией головного мозга, мышеч­ной спастичности, нарушением строения скелета, дегенерацией длинных костей (болезни Тея-Сакса, Гоше, Фабри и др.), в основном обусловленных дефицитом ферментов, расщепляющих эти липиды (табл.6).

Рис.12. Модель молекулы ганглиозида (Из: Страйер,1985)

Холестерол (рис.13) - третий класс основных липидов мембран, относится к стероидам и является полициклическим спиртом . Состоит из 4 углеводородных колец, обозначаемых буквами А,В,С,Д (рис.13.Б), разветвленной боковой цепи из 8 углеродных атомов и гидроксильной группы (рис.13,В). Он является предшественником всех стероидных гормонов и из него образуются желчные кислоты. Холестерол - гидрофобное соединение, находится в срединной зоне

бислоя между цепями «хвоста»; обычно скапливается в наружном слое, утолщая его и увеличивая жесткость мембран (рис.14). Холестерол сос -

Таблица 5

Мукополисахаридозы (Из: Фаллер, Шилдс, 2004)

Таблица 6

Заболевания, связанные с нарушением метаболизма сфинголипидов

тавляет 40% липидов мембран эритроцитов, много его в нервной ткани. Наряду с полезной биологической ролью, при нарушении обмена липидов, холестерол может стать причиной возникновения атеросклероза.

Рис.13. Модель молекулы холестерола (А), четыре углеводородных

кольца (Б) и формула молекулы холестерола (В) (Из: Страйер,1985;

Сеитов, 2000)

Рис.14. Положение молекулы холестерола в мембране (Из : Страйер, 1985)

Молекулы липидов являются, как говорилось выше, амфифильными молекулами, вследствие этого, в водной среде они принимают многомолекулярные конфигурации с упорядоченным расположением молекул: гидрофильные головки контактируют с водой, а гидрофобные концы друг с другом и гидрофобными веществами – маслом, воздухом и неамфифильными липидами:

а) на границе вода – масло или вода – воздух липиды образуют монослой, в котором головки контактируют с водой, а хвосты обращены к воздуху (рис.15);

Рис.15. Липидный бислой на границе сред вода-масло (а) и вода – воздух (б)

(Из: Де Дюв, 1987)

б) если монослой, погрузить в воду, то неполярные гидрофобные хвосты объединяются друг с другом, отделяясь от водной среды, что приводит к замыканию монослоя с образованием сферических пузырков – мицелл (рис.16,а), в которых головки обращены наружу, а хвосты внутрь. Мицеллы образуются также в водной среде, содержащей капли масел (рис.16.б); в этом случае монослой окружает каплю масла, головки в мицелле обращены к воде, а хвосты к маслу;

Рис.16.Мицеллы фосфо- липида на границе сред вода-воздух(а) и вода-масло (б) (Из: Де Дюв, 1987)

в) на границе двух жидкостей (например: вода-вода) липиды обладают способностью образовывать двуслойные структуры - липидный бислой; гидрофобные части (хвосты) вытесняются из водной среды и взаимодействуют друг с другом, а гидрофильные контактируют с водой. Таким образом, образуется плоский бислой, в котором головки обращены к воде, а хвосты друг к другу (рис.17).

Бислой, погруженный в водную среду спонтанно смыкается, образуя везикулы (рис.18) - пузырьки, которые в клетке выполняют многочис - ленные функции.

Фосфолипидные, созданные искусственно состоящие, из двух и более бислоев, везикулы называются липосомы, в которых «головки» обращены в стороны воды, а «хвосты» - вовнутрь и контактируют друг с другом с помощью ванн-дер-ваальсовых сил. Количество слоев в липосоме (рис.19) зависит от способа их получения. Получить липосомы можно при обработке суспензии, содержащей фосфолипиды в водной среде ультразвуком (рис.20). Многослойные липосомы имеют в диаметре 0,5-10 мкм, однослойные 25-100нм.

Рис.17. Бислой липидов на

границе сред вода-вода Рис.18. Везикула липидного бислоя

(Из: Де Дюв, 1987)

Рис.19. Срез липосомы, состоящей из одного (а) или более (б) бислоев

(Из : Страйер,1985)

Липосомы используются для изучения:

1 - трансмембранной проницаемости и влияния на нее фармаколо- гически активных веществ;

2 - роли отдельных липидов мембран и взаимодействию липидов и белков в мембране;

3 - процессов взаимодействия антигенов и антител с мембранами клетки;

4 - возможности использования липосом в качестве особых лекарственных форм, обеспечивающих транспорт лекарственных веществ в организме, где определенные липосомы могут улавливаться органами-акцепторами и разрушаться в клетке.

Таким образом, можно обеспечить адресную доставку лекарственных веществ в строго определенное место – пораженный орган. Это может быть достигнуто путем подбора определенных компонентов в мембранах протеолипосом – искусственно созданных липосом, бислои которых содержат молекулы белков. Такие липосомы избирательно будут задерживаться в том или ином органе.

Использование липосом в доставке лекарственных веществ имеет ряд преимуществ:

1 - липосомы легко проникают через мембраны, следовательно, транспорт веществ будет более эффективным;

2 – липосомы не является чужеродными для организма и поэтому неблагоприятного действия не оказывают;

3 - липосомы сохраняют интактность транспортируемых веществ, предохраняя от связывания их с белками цитоплазмы; действия ферментов; предотвращают иммунную реакцию организма на вводимые вещества;

4 - транспортируемые липосомами лекарственные вещества имеют более пролонгированное действие, так как, высвобождаются из липосом медленнее, чем из капсулы.

Рис.20. Способ получения липосом (Из : Страйер,1985)

Липосомы и мицеллы являются транспортными формами переноса веществ в клетку и из нее; при этом липосомы переносят водорастворимые вещества, а мицеллы - жирорастворимые. Так, транспортные пузырьки, отпочковывающиеся от ЭПС и аппарата Гольджи, пиноцитозные и сек­реторные пузырьки - все это липосомоподобные структуры (отличаются от липосом наличием белковых молекул). Мицеллы - это форма переноса веществ, в виде которой всасываются в кишечнике продукты переваривания жиров, жирорастворимых витаминов и липидов (рис.16,б).

Липидный бислой в клетке формируется спонтанно; он устойчив по термодинамическим причинам, а не за счет ковалентных связей и определяет такие свойства биомембран как подвижность, цельность мембран и непроницаемость для ионов, полярных молекул и молекул, растворенных в воде.

I. Подвижность мембран. Липидный бислой - жидкое образование, в пределах которого молекулы могут свободно передвигаться, без потери контактов друг с другом. Степень жидкостности (текучесть) бислоев зависит от способности гидрофобных хвостов свободно скользить относительно друг друга. Скорость передвижения молекул зависит от вязкости мембран, которая определяется количеством СН-групп в ацильных цепях, числом двойных связей в цепи, количеством холестерола I в бислое и температуры. Чем длиннее ацильные цепи «хвоста», тем плотнее упако- ваны липиды. Ацильные остатки ненасыщенных жирных кислот имеют, так называемые, «изломы» в структуре, которые препятствуют слишком плотной упаковке молекул в мембране и делают ее более рыхлой, а следовательно, более «текучей». Степень упаковки мембран влияет на ус­тойчивость мембран: чем выше степень, тем выше устойчивость.

Липиды различных типов встраиваются в мембрану не случайно и образуют на мембране поля - участки с различными свойствами, выпол- няющие определенные функции. Например, в тех местах мембран, которыми клетка прикрепляется к другой клетке, концентрируются липиды с насыщенными ацильными цепями, что делает этот участок жестче.

Оба слоя мембраны различаются по липидному составу, поэтому поля могут возникать только на одной из сторон мембраны. Следовательно, мембрана представляет собой липидную мозаику. Различие поверхностей бислоя по составу липидов называется трансмембранной (поперечной) ассиметрией.

Трансмембранная ассиметрия мембран возникает вследствие способности липидов передвигаться с одной стороны мембраны на дру- гую. Это направление движения называется трансмембранной миграцией, или поперечной диффузией, или «флип-флоп» перескоком (от анг.flip-flop) (рис.21).

Рис.21. Типы движений липидных молекул в бислое мембраны

Скорость таких перескоков зависит от размеров головки молекулы. Так как, на внутренней стороне мембраны находятся молекулы с меньшими размерами головок, то и миграция их в наружную мембрану осуществ- ляется быстрее. Такие перемещении липидов называются также транс -локацией липидов. Флип-флоп перескок или транслокация липидов - редкое событие, так как требует больших затрат энергии. Его осуществление и приводит к ассиметрии мембран, что очень важно для выполнения некоторых функций клетки. Например, фосфотидилсерин несет отрицательный заряд; его концентрация во внутреннем слое мембраны больше, поэтому она становится отрицательно заряженной по отношению к внешнему слою, что оказывается важным при передаче внешнего сигнала в клетку.

Кроме этих перемещений в бислое происходит также движение в плоскости мембран или латеральная диффузия: молекулы липидов постоянно перемещаются по мембране в пределах слоя, а также могут крутиться вокруг своей оси (рис.21).

II. Цельность мембран обеспечивается способностью бислоя к самозамыканию. В основе этого явления лежат нековалентные взаимо- действия: бислой устойчив по термодинамическим причинам, а, именно, липидные бислои стремятся к замыканию на себя так, чтобы на концах не оставалось ни одной доступной для контакта с водой углеводородной цепи. В результате такого замыкания могут возникнуть ограниченные пространства – компартменты. Липидный бислой самозапечатывается, так как любая дырка в бислое энергетически не выгодна.

III. Непроницаемость мембран для молекул, растворенных в воде и ионов, связана с особенностями расположение гидрофобных хвостов липидов бислоя. Для прохождения через бислой, гидрофильные молекулы должны пересечь маслянистую пленку из гидрофобных хвостов липидных молекул. Для того, чтобы преодолеть этот барьер вещество должно быть гидрофобным или пройти через случайные щели в бислое. Щели возникают при изменении температур, которое вызывает молекулярные перемещения молекул бислоя. В такие щели протискиваются молекулы воды и очень мелкие молекулы.

Липидный бислой может обеспечить транспорт веществ через себя только при наличии специфических молекул – мембранных белков.

Состав липидов в мембранах влияет на их свойства. Внешние мембраны содержат больше гликолипидов и холестерина, а внутренние - фосфолипидов (табл.7; рис.22). Это объясняется следующими свойствами липидов:

1) Фосфолипиды и сфинголипиды: строение их углеводородных «хвостов» затрудняет взаимодействие между соседними цепями и делает структуру бислоя менее упорядоченной и менее стабильной, что приводит к:

а) повышению латеральной диффузии компонентов мембран из-за уменьшения взаимодействия между молекулами;

б) увеличению диффузии неполярных соединений через мембрану из-за возрастания промежутков между «хвостами» липидов;

в) повышению способности мембран к разрыву.

В силу этого фосфолипиды и сфинголипиды относят к «дестабилизирующим» липидам, увеличивающим лабильность мембран.

2) Гликолипиды и холестерин. Длинные «хвосты» гликолипидов практически, лишенные двойных связей и молекулы холестерина между ними препятствуют активному перемещению липидов. Это делает мембрану более стабильной, поэтому гликолипиды и холестерин относят к «стабилизирующим» липидами.

С возрастом количество холестерола в мембранах повышается, что делает их менее ла­бильными и проницаемыми. Под действием специфического белка, способствующего замене холестерола на фос - фолипиды происходит понижение концентрации холестерола в мембранах сперматозоидов, что приводит к разрыву плазмолеммы акросомы при его контакте с оболочками яйцеклет­ки.

Таблица 7

Химический состав мембран

(Из: Мушкамбаров, 2003)

Рис. 22. Химический состав биомембран (Из: Интернет-ресурсы;

Биомембраны: структура и функции)

Таким образом, чем выше концентрация в мембранах гликолипидов и холестерола, тем мембраны прочнее и менее проницаемы; чем выше концентрация фосфолипидов и сфинголипидов, тем больше мем­браны склоны к разрывам, а проницаемость их выше.

Липиды выполняют ряд важных функцией:

1 - липиды являются основными структурными молекулами, обеспечивающие формирование бислоя;

2 - влияют на электропроводность мембран;

3 - липидный бислой работает как физический барьер при участии мембран в транспорте веществ;

4 - обеспечивают условия функционирования мембранных белков, влияя на формирование необходимой конформации молекулы;

5 - принимают участие в передаче внутриклеточных сигналов: явля- ются источником получения и интерпретации поступающих сигналов, а также становятся участниками реакции на них клетки. Так, фосфатидил-инозитол-4,5-бисфосфат (ФИФ₂) под действием фермента фосфолипазы С гидролизуется до диацил-глицерала (ДАГ) и инозитол-трифосфата (ИФ₃). ДАГ и ИФ₃ являются участниками процесса передачи сигнала;

6 - играют роль «якоря» для прикрепления специфических белков на наружной поверхности мембраны (рис.23);

7 - липиды могут выступать в роли активаторов мембранных фермен- тов. Например, протеинкиназа С находится в цитоплазме в неактивном состоянии. При повышении концентрации кальция фермент активизируется ионами Са⁺, связывается с ДАГ (см.выше) и осуществляет катализирование реакции фосфорилирования белков.

Рис.23. «Якорная» функция фосфотидилинозитола (Из: Северин, 2007)

Синтез липидов мембран осуществляется на поверхности мембран эндоплазматической сети, затем молекулы липидов переносятся в плазма­тическую мембрану транспортными пузырьками.

1.1.2. Белки мембран

Белки мембран составляют 50% от массы клеточных мембран. Их роль заключается в том, что они обеспечивает функциональную активность мембран, а именно:

1 - участвуют в транспорте веществ;

2 - входят в состав транспортных насосов и ионных каналов;

3 - являются ферментами и рецепторами, учавствуя в проведении сигналов в клетку;

4 - связывают цитоскелет с внеклеточным матриксом;

5 - преобразуют энергию пищевых веществ в химическую энергию макроэнергетических связей молекулы АТФ.

Белки мембран, контактирующие с липидами, имеют преимущест- вено неполярные аминокислоты в участках, взаимодействующих с хвос- тами липидов и гидрофильные аминокислоты в участках, взаимодейс- твующих с головками липидов. Поэтому мембранные белки связываются с липидами:

1 - амидной связью между N-концевым остатком аминокислоты и карбоксильной группой хвоста липида;

2 - карбоксильным концом;

3 - через образование тиоэфирной связи с участием ЅН-группы цис- теина четвертого остатка с С-конца;

4 - ковалентно привязываются к мембране через углерод с помощью фосфодиэфирной связи. Такие белки называются прикрепленными к глицеролфосфогенозидному якорю; одни из них является рецепторами проведения сигнала, другие - поверхностными зонами узнавания клетки.

Содержание белка в разных мембранах колеблется от 18% (миелиновая оболочка нервов) до 50% (мембраны, содержание насосы, каналы, рецепторы, ферменты) или 70% (мембраны, преобразователи энергии у митохондрий и хлоропластов).

Белки мембран обеспечивают одно из свойств мембран - полупроницаемость для воды и низкомолекулярных соединений.

По месту расположения в мембране белки делятся на интег - ральные и поверхностные (периферические) (рис.24).

Интегральными называются белки, погруженные в толщу бислоя. Они могут находится во внешнем или внутреннем слоях бислоя липидов мембраны или локализоваться между ними. Некоторые интегральные белки пронизывают бислой насквозь. В этом случае они называются трансмем­бранными интегральными белками (рис.25) и состоят из 3 участков:

1 - внеклеточного домена, выступающего над внешней стороной мембраны и связанного с углеводной частью белка;

2 - трансмембранного домена, локализованного в липидном бислое;

3 - внутриклеточного домена, погруженного в цитоплазму клетки.

Рис. 24. Расположение белков в липидном бислое мембраны: трансмембранные белки: 1-гликофорин; 2-рецептор; 3-белок, связанный с интегральным белком;

периферические белки: 4-белок протеинкиназа С, присоединенная к липидам

бислоя; 5-белок, заякоренный в мембране с помощью концевого домена; 6-белок заякоренный в мембране с помощью ковалентной связи с липидом мембраны.

Рис.25. Трансмембранные интегральные белки мембран:

1-монотопный белок, рецептор липопротеинов; 2-4- полипотные белки с разным числом трансмембранных доменов.

Трансмембранные интегральные белки бывают монотопными и политопными. Монотопные белки пересекают мембрану один раз, так как имеют только один трансмембранный участок полипеп­тидной цепи (белок гликофорин, рис.26). Многие монотопные белки являются рецеп­торами. Политопные белки пересекают мембрану несколько раз, то есть, имеют несколько трансмем­бранных доменов и, также, в большинстве своем являются рецепторами, активирующими переда­чу сигналов внутрь клетки (рис.27).

Рис.26. Схема монотопного белка глико- форина: а- внеклеточный домен; б – тран- смембранный домен; в – цитоплазматичес-

кий домен (Из: Мушкамбаров, 2003)

Поверхностные (периферические) белки – это белки, которые связаны только с одной из поверхностей мембран (внешней или внутренней). Они связываются с мембраной через интегральные белки или липиды бислоя, образуя связи белок-белок или белок-липиды.

К периферическим белкам относятся:

1 - некоторые пищеварительные ферменты, прикрепляющиеся к интегральным белкам мембран микроворсинок тонкого кишечника. Например, сахаро-изомальтазный комплекс (рис.28) состоит из 2 поли- пептидных цепей : сахаразы и изомальтазы, которые являются ферментами, расщепляющими углеводы сахарозу и изомальтозу;

2 - протеинкиназа С - фактор свертывания крови;

3 - гемопротеины - цитохромы а, б и с мембран митохондрий, участвующие в переносе электронов по дыхательной цепи;

4 - фибронектин, белок наружной поверхности мембран (у всех клеток, кроме клеток, циркулирующих по крови) и спектрин, белок внутренней поверхности клеточных мембран, чаще всего эритроцитов (рис.29).

Р ис.27. Политопные серпантинные белки: β₂-адренгический рецептор – родопсин (А) и р-гликопротеин (Б), обеспечивают экскрецию ионов хлора и гидрофобных токсич -

ных соединений из клетки.

Рис. 28. Сахаразо – изомальтазный комплекс: 1-сахараза; 2-изомальтаза; 3-связывающий домен; 4-трасмембранный домен; 5-цитолазматический домен.

Периферические белки тесно связаны с интегральными белками мембран белок - белковыми взаимодействиями и играют роль в функцинировании цитоскелета. Так, белок фибронектин связан с интегральным белком интегрином и т.д. (рис.30).

Подобно липидам, интегральные белки мембран способны перемещаться в плоскости отдельных слоев мембран, то есть латерально (рис.31), но флип-флоп перескоки совершать не могут. Белковые молекулы рас­полагаются в бислое мозаично и могут «плавать» в «липидном море» наподобие айсбергов. В пе­ремещении белков важную роль играют элементы цитоскелета (подробнее ниже). При межклеточных взаимодействиях происходит их концентрация на взаимодействующих поверхностях плазмолеммы в виде агрегатов.

Рис.29. Схемы периферических белков фибронектина (А) и спектрина (Б):

А - фибронектин - бе - лок межклеточного мат- рикса; состоит из 2 по- липептидных цепей; обеспечивает адгезию клеток;

Б - спектрин – белок мембраны эритроцита: состоит из четырех по - липептидных цепей – 2α и 2 β (Из: Северин, 2007)

Рис.30. Белок интегрин – рецептор фибронектина (а) и его взаимодействие с фибронектином (б). Интегрин состоит из двух полипептидных цепей с короткими внутриклеточными и длинными N-внеклеточными доменами. Интегрин связывает белок фибронектин, который обеспечивает адгезию, миграцию клеток; связывает клетки с внеклеточными матриксом

Взаимодействие мембранных белков и липидов было описано Д.Зингером и Г.Николсоном (1972), предложившим модель мембраны, в которой большая часть белков погружена в мембрану почти перпенди- кулярно, однако, они не закреплены, а подвижны благодаря текучести мембраны. Такая модель называется жидкостно-мозаичной квазикристал- лической.

По функциям белки мембран делятся на:

1 - структурные;

2 - транспортные;

3 - адгезивные (обеспечивающие меж­клеточные взаимодействия);

4 - участвующие в передаче сигналов от одной клетки к другой;

5 - каталитические.

Структурные белки: придают клетке и органеллам форму; придают мембране те или иные механические свойства (эластичность, прочность и др.); обеспечивают связь мембраны с цитоскелетом или у ядерной мемб- раны - с хромосомами.

Транспортные белки - обеспечивают транспорт через мембра­ну высокомолекулярных веществ, размеры которых не позволяют транспортировать их в клетку через липидный бислой. Эти белки образуют транспортные системы и каналы, осуществляющие устойчи- вые транспортные потоки веществ че­рез мембраны. Кроме того, транспорт ионов приводит к возникновению трансмембранного потенциала во всех клетках; в нервных клетках и нервах его изменение лежит в основе проводимости и возбудимости.

Белки, обеспечивающие межклеточные взаимодействия – это адгезивные белки, связывающие клетки друг с другом, базальной мемб- раной, волокнами и белки, участвующие в образо­вании межклеточных контактов (десмосом и пр.).

Каталитические белки – это белки, учавствующие в ферментных реакциях, происходящих на мембране.

Рис.31. Движение белков в мембране. Липидной бислой обозначен в виде круга; молекулы белков - поперечными полосами; звездочками обозначены некоторые белковые молекулы одной мембраны (А); при слиянии двух мембран (Б) белки одной мембраны, обозначенные звездочками, распространились по поверхности другой мембраны (В) (Из: Фаллер, Шилдс, 2004)

Белки, участвующие в передаче сигналов извне в клетку и из одной клетки в другую. К ним относятся:

1 - белки, являющиеся рецепторами внешнего сигнала;

2 - белки ионных каналов (белки эффекторного устройства);

3 - белки инактиваторы внешнего медиатора;

4 - белки, образующие внутренний медиатор;

5 – белки, передающие сигнал через мембрану.

Наиболее детально изучены мембранные белки плазмалеммы эритроцитов. На внутренней цитоплазматической поверхности плазма- леммы эритроцитов находится гибкая сетевидная структура - филаментная сеть, которая поддерживает форму эритроцита и противостоит давлению при прохождении его через тонкий капилляр, а также за подвижность и распределение интегральных мембранных белков. Эта структура получи-

ла название мембранного скелета или примембранного актин-спектринового цитоскелета (рис.32).

В плазмалемме эритроцита идентифицировано 15 главных белков с молекулярной массой 15-250 кДа. Более 60 % всех белков составляют примембранный белок спектрин, мембранные белки - гликофорин и белок полосы 3. Спектрин составляет 25 % массы всех мембранных и примембранных белков эритроцита, является белком цитоскелета, связан- ным с цитоплазматической стороной плазмалеммы, участвует в поддержании двояковогнутой формы эритроцита.

Рис. 32. Схема строения примембранного актин-спектринового цитоскелета (Из: Интернет-ресурсы – Цитоскелет. Структура и функции)

Данные о структуре этих белков получены при разделении мембран эритроцитов методом электрофореза в полиакриламидном геле. Мембраны обрабатывают додецилсульфатом натрия (ДСН), который разрушает связи белок-белок и белок-липиды между молекулами белков и липидов, входящих в их состав. Полученный раствор молекул помещают на полиакриламидный гель и в электрическое поле. Под действием электрического поля белки мембран разделяются на фракции и на электрофореграмме выглядят в виде полос разной ширины (рис.33-34).

Рис.33. Электрофореграмма

плазмолеммы эритроцита

(Из: Страйер,1985)

Рис.34. Строение плазма - леммы и цитоскелета эрит- роцита:

А - схема: 1 – плазмалем- ма; 2 - белок полосы 3; 3 - гликофорин; 4 - спектрин (а- и β-цепи); 5 - анкирин; 6 - белок полосы 4.1; 7 - узловой комплекс; 8 - актин;

Б - плазмалемма и цито- скелет эритроцита в скани- рующем электронном мик- роскопе:1 – плазмалемма; 2 - сеть спектрина (Из: Страйер,1985)

В состав мембран эритроцитов входят следующие белки:

1. Спектрин (рис.34;35,А) и его неэритроцитарный аналог фодрин характерны для клеток большинства тканей позвоночных, беспозвоноч- ных животных и высших растений. Спектрин - фибриллярный периферий- ный белок, связанный с внутренней поверхностью плазмалеммы. Диаметр 2 нм, длина 200-260 нм. Всего в плазмолемме эритро­цитов 200 тысяч молекул спектрина. Его масса в клетке составляет около 3О% массы мембранных белков.

Молекула спектрина состоит из двух больших полипептидных цепей (около 22О и 24О кДа каждая). Спектрин является тетрамером, состоящим из 2 α- и 2 β-цепей. α- и β-цепи, попарно перекручиваясь друг с другом, соединяются в нескольких точках антипараллельно и нековалентно, образуя два гетеродимера. Эти гетеродимеры также перекручиваются, формируя тонкую, гибкую фибриллу - тетрамер. Мономеры спектрина в составе тетрамера слабо взаимодействуют по всей длине α- и β-цепей; N-концевые домены β-субъединиц прочно связаны с С-концевыми доменами α-субъединиц. Спектриновые димеры собираются путем самосборки в тетрамеры и олигомеры более высокой организации. α-субъединица спектрина содержит участки связывания белка кальмодулина, а β-субъединица - белков актина и анкирина.

Рис.35. Белки мембран эрит -роцитов крови:

А-строение спектрина;

Б - околомембранный белко- вый комплекс;

В - цитоскелет эритроцитов

(Из: Северин, 2007)

Спектрин составляет 25 % массы всех мембранных и примембранных белков эритроцита и являясь белком цитоскелета, связанным с цитоплазматической стороной плазмолеммы, участвует в поддержании двояковогнутой формы эритроцита.

2. Гликофорин (рис.35,б; 36) - интегральный мембранный глико- протеин. Он пронизывает мембрану и с обеих сторон вы­ступает над ее поверхностью. Всего в плазмолемме эритроцита 360000 молекул глико- форина. Гликофорин состоит из 2-х субъединиц; каждая включает пептидную цепь из 161 остатка аминокислоты и 16 олигосахаридных цепей. Углеводный компонент белка составляет 60% массы гликофорина. В пептидной цепи гликофорина 3 участка:

а - N-концевой участок (50 остатков аминокислот) выступа­ет на внешней стороне мембраны и связан с углеводной частью белка; моносахариды этих цепей являются сиаловой кислотой, имеющей заряженные отрицательно группы. Благодаря этому эритроциты несут на внешней стороне значительный отрицательный заряд, препятствующий их слипа­нию. По мере старения происходит потеря сиаловой кислоты и снижение заряда, что способствует захвату эритроцита макрофагом. Таким образом, N-концевой конец определяет продолжительность жизни эритроцита. Кроме того, гликофорин содержит антигенные детерми- нанты - агглютиногены А и В. Они обеспечивают агглютинацию (склеивание) эритроцитов под влиянием соответствующих белков плазмы крови: а- и β-агглютининов, входящих в состав фракции γ-глобулинов.

Рис.36. Белок гликофорин мембраны эритроцита (Из: Страйер,1985)

б - срединный участок (30 остатков аминокислот) проходит через липидный бислой, то есть, являет­ся трансмембранным доменом и имеет вид α-спирали, аминокислоты которой несут неполярные радикалы.

в - С-концевой участок расположен на внутренней поверхности мембраны и обогащен заряжеными и полярными радикалами. С ними связываются актиноподобные белки, а с последними – элементы цитоске- лета клетки (микрофиламенты). Таким образом, гликофорин служит также местом прикрепления цитоскелета и, в отличии от других белков мембраны эритроцита, характерен только для мембран эритроцитов.

3. Белок, образующий анионный канал или белок полосы 3 (рис.35б, 37) - это интегральный гликопротеин, содержащий 2 субъединицы, полипептидные цепи которых много раз пересекают бислой липидов. Между субъединицами образуется пора (ка­нал), «стенки» которой выстланы гидрофильными радикалами аминокислот, через канал проходят анионы (Сl^‾, НСО‾з, ОН‾) и глюкоза по механизму пассивного антипорта (перенос через мембрану двух разных веществ в противоположных направлениях; рис. 38). Следовательно, белок полосы 3 является транспортным трансмембран- ным белком и образует анионный канал. Для транспорта катионов в мембране эритроцитов транспорт­ных систем нет.

Рис.37. Белок полосы 3 (анионный канал) мембраны эритроцитов (Из: Страйер,1985)

Рис.38. Транспорт анионов НСО^-₃ и Сl^- через мембрану эритроцитов: А- в венозных капиллярах анион НСО₃, образованный при диссоциации Н₂СО₃, выходит из эритроцита в кровь. В обмен на анион НСО₃ транслоказа переносит в эритроцит ион Сl^-, Б-легких обмен ионов идет в обратном направлении. Таким образом, обеспечивает удаление СО₂ из организма (Из: Северин, 2007)

.

Анионные каналы обеспечивают транспорт эритроцитов, а также транспорт СО₂ из тканей в плазму крови и в малом круге кровообращения. Важность этих функций очевидна, так как на мембране эрит­роцита находится 600000 анионных каналов, на которые приходится 10% площади мембраны и 15%массы всех белков плазмолеммы. Этот гликопротеид участвует в переносе кислорода из легких к тканям и углекислого газа из тканей к легким. Находясь в легких, эритроциты избавляются от углекислого газа путем замены аниона НСО^-₃ на анион Сl. Белок полосы 3 участвует также в обмене О₂ и СО₂, которые связывают гемоглобин - основной белок цитоплазмы эритроцита. Белок полосы 3 обеспечивает анионам НСО^-₃ и Сl^- трансмембранный проход через гидрофильные "поры", окруженные гидрофобными липидными зонами. Таким образом, формируются водные ионные каналы.

Молекулярная масса белка полосы 3 составляет около 1ОО кДа и содержит небольшой углевод, выступающий на наружной поверхности клетки. Белок носит название полосы 3, поскольку при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии ДСН он занимает соответствующее положение относительно других белков мембраны.

Мутация гена белка полосы 3 (делеция) делает мембрану эритроцита ригидной и защищает эритроциты от внедрения малярийных плазмодиев Недостаточность этого белка наследуется аутосомно-доминантно и приводит к легкой форме анемии.

4. Nа⁺,К⁺,-насос - это Nа⁺,К⁺,-зависимая АТФаза (рис.39), интегральный гликопротеид, насчитывающий всего несколько сотен моле- кул на эритроците и состоящий из 4 субъединиц - 2α и 2β. Послед­ние находятся на наружной поверхности мембраны и с ними связываются олигосахаридные цепи. Na⁺, К⁺,-насос, используя энергию АТФ, выкачивает из эритроцита ионы Na⁺ в обмен на ионы К⁺ и Н⁺ (подробнее механизм будет описан ниже).

А Б

Рис.39. Na⁺, К⁺-зависимая АТФаза: А - Na⁺, К⁺-зависимая АТФаза состоит из 2α и 2β субъединиц; Б - механизм работы Na⁺, К⁺- зависимой АТФазы: 1 – 6 - этапы работы насоса, обеспечивающие транспорт Na⁺ из клетки и К⁺ - в клетку (Из: Северин, 2007)

5. Белки полосы 4.1 и 4.2 (рис.35,б) - периферические белки мембран, связывающие спектрин с актином, а белок полосы 3 - с анкирином. Цитоскелетный белок полосы 4.1, связывающий спектрин и актин, одновременно соединяется с белком гликофорином. На внутренней цитоплазматической поверхности плазмолеммы образуется гибкая сетевидная структура, которая поддерживает форму эритроцита и противостоит давлению при прохождении его через тонкий капилляр (см. рис.14).

6. Анкирин (рис.35,в) (от греч. аnkyr - якорь) - это белки полос 2.1; 2.2.; 2.3.; 2.6, которые являются периферическими крупными мембранными белками (210 кДа), связывающими примембранный актин-спектриновый цитоскелет с интегральным мембранным белком полосы 3 и уменьшающими его диффузию в липидном бислое. В настоящее время лучше всего изучены анкирины, выделенные из эритроцитов и мозга, соответственно, анкирин R и анкирин В с молекулярной массой 202 и 206 кДа. Молекула анкирина состоит из трех доменов: N-концевого или мембраносвязывающего, промежуточного или спектринсвязывающего и С-концевого регуляторного.

Анкирин - это фосфопротеин с молекулярной массой 210 кД. Он связывается с головным участком β-субъединицы спектрина и с цитоплазматическим доменом белка полосы 3. Фосфорилирование анкири- на уменьшает его способность связываться со спектрином.

С белком полосы 3 анкирин связывается, когда он находится еще в полостях эндоплазматической сети или в первом компартменте комплекса Гольджи, и в таком виде встраивается в мембрану. Анкирин связывается только с тетрамерами белка полосы 3; недостаток анкирина является причиной исчезновения большинства анкирин-связывающих участков, расположенных на мембране эритроцита, что приводит к деформации формы эритроцита. Нарушение связывания анкирина с белком полосы 3 может быть вызвано делецией N-концевой части молекулы на участке первых 79 аминокислотных остатков.

Недостаточность анкирина приводит к развитию анемии; наследуется аутосомно-рецессивно или аутосомно-доминантно; аутосомно-рецессивное наследование встречается реже, но анемия при нем тяжелее.

7. Актин (рис.35) – глобулярный белок с массой 43 кДа. В резуль- тате полимеризации (см. ниже, Цитоскелет) образует актиновые филаменты.

Цитоскелет мембран эритроцитов формируется из почти всех вышеперечисленных белков. Выявлено несколько звеньев соединения белков, обеспечивающих жесткость мембраны:

1. спектрин - анкирин - цитоплазматический домен белка полосы 3;

2. спектрин - белок полосы 4.1 - интегральные белки гликофорины;

3. спектрин - аддуцин (кальмодулинсвязующий белок) - молекулы фосфолипида - фосфатидилхолина.  Спектрин являются основным белком цитоскелета эритроцита (рис.40).

Рис.40. Цитоскелет эритроцита (Из: Фаллер, Шилдс, 2004)

Тетрамеры спектрина (рис.35А,В), соединяясь, образуют разветвленную волокнистую сеть. Концы тетрамеров спектрина связаны с короткими актиновыми филаментами цитоплазмы, белком тропомиозином и белком полосы 4.1, образуя "узловой комплекс" (рис.34). Еще два мембранных белка белок полосы 4.1 и аддуцин соединяются со спектрин-актиновым соединением «узловой комплекс» и помогают прикреплению более длинного спектринового филамента к белку мембра­ны, глубоко погруженному в бислой – гликофорину (рис.35,в;39). Белок анкирин соединяет центр тетрамера спектрина и главный анионно-обменный белок - белок полосы 3.

Таким образом, образуется сетка молекул (рис.32;35,в), которая обеспечивает жесткость мембраны и поддерживает двояковогнутую форму эрит­роцита (рис.41), а также способствует изменению формы эритроцитов при прохождении ими через мелкие кровеносные сосуды (рис.42).

Рис.41. Электронограмма эритроцитов

плазмы крови: видна их двояковогну- тая форма (Из: Страйер,1985)

Рис.42. Изменение формы эритроцитов при прохождении

через мелкие кровеносные сосуды (Из: Страйер,1985)

Генетические изменения любого из этих белков могут изменить форму эритроцита и при­вести к клиническим нарушениям. Так, дефицит спектрина приводит к аутосомно-доминантному наследственному сфероцитозу; инсерция анкирина - к аутосомно-доминантному наследст- венному эллиптоцитозу и т.д. (табл.8). . Доказано, что при наследственной аномалии спектрина эритроциты имеют сферическую форму. При недостаточности спектрина в условиях анемии эритроциты также принима-

ют сферическую форму.

Таблица 8

Генетические нарушения при наследственных дефектах

цитоскелета эритроцитов (Из: Фаллер, Шилдс, 2004)

Причинами, обусловливающими возникновение дефектов структуры мембран эритроцитов, являются генетические аномалии мембранных белков. Фенотипически они проявляется в виде изменений формы эритроцитов (сфероцитоз, эллиптоцитоз, пиропойкилоцитоз) и повышенной склонностью эритроцитов к гемолизу. Наиболее часто встречаются:

1 – мутация спектрина ^I/74 (формирование пептида с молекулярной массой 74 кДа) - приводит к повышению склонности эритроцитов к гемолизу;

2 - мутация спектрина^I/78(формирование пептида с молекулярной массой 78 кДа) - проявляется умеренным эллиптоцитозом;

3 - мутация спектрина ^I/65(формирование пептида с молекулярной массой 65 кДа) - клинически проявляется в виде эллиптоцитоза и гемолитической анемии. Мутантные формы спектрина обеспечивают некоторую степень защиты от малярийной инвазии. 

4 аномалии анкирина - связаны с дефицитом анкирина. Он может быть обусловлен снижением синтеза его молекул, как следствие снижения уровня транскрипции ДНК и малого количества мРНК анкирина. Другой причиной низкого содержания молекул анкирина в эритроцитах, до 40% от нормы, является делеция гена анкирина в коротком плече 8 хромосомы. Фенотипически дефицит анкирина проявлялся развитием наследственного сфероцитоза эритроцитов, обусловленного снижением числа молекул спектрина, включаемых в мембрану эритроцита и нарушением его цитоскелета.

5 - аномалии белка полосы 3 (анионного обменника) - связаны также с его дефицитом, возникающим вследствие генных мутаций (замена оснований). Следствием дефицита этого белка и изменений в его структуре является нарушение и низкая эффективность анионного транспорта. Проявляется эта мутация овалоцитозом эритроцитов.

Другие мутации белка полосы 3 обусловлены двумя молекулярными дефектами, вызванными заменами оснований и делециями девяти аминокислот. Фенотипически эти мутации проявляются акантоцитозом- аномалии эритроцита, при которой белок полосы 3 имеет большую, в отличие от нормальной, молекулярную массу и меньшее количество мест связывания для анкирина.

6 - аномалии гликофоринов  - генетические нарушения молекул гликофоринов А, В и С, связаные с дефектами генов гликофорина в вось- мой хромосоме. Уменьшение содержания гликофоринов проявляется рецессивно наследуемой анемией с элиптоцитозом эритроцитов. Молеку- лярной основой дефицита гликофоринов является делеция 3 и 4 экзонов в их генах.

  Как показало изучение цитоскелета других клеток, модель цитоскелета эритроцита верна и для других типов эукариотических клеток. Различие составляют количество и типы связывающих белков; наличие спектрина, анкирина и актина характерно для всех типов клеток .

Кроме белков и липидов в состав мембран входят углеводы (10%) как составные части липидов (гликолипиды) и белков (гликопротеины).

Все молекулы белков, липидов и углеводов объединяются в мембраны путем самосборки при соблюдении следующих главных принципов строения и свойств мембран:

1 - мембраны не однородны, то есть мембраны разных органелл и плазмолеммы отличаются по составу.

2 - мембраны является плоскими структурами, разграничивающи- ми отдельные компартменты цитоплазмы. Толщина мембран эукариотических клеток в среднем составляет 60-100А.

3 - липиды мембран является амфифильными молекулами и образу- ют замкнутый бислой, который служит барьером для полярных соедине- ний.

4 - функции мембран опосредуются специфическими мембранными белками, встроенными в липидный бислой, который определяет проявление их активности.

5 - мембраны нековалентные надмолекулярные структуры; белки и липиды удерживаются вместе за счет возникновения нековалентных взаимодействий;

6 - компоненты мембран находятся в состоянии непрерывного движения. Белки перемещаются в пределах мембраны со скоростью 2,5 мкм за 10 сек., а липиды - 5,5 мкм за это же время. Молекулы липидов и белков спо­собны совершать вращательные движения, меняя свою ориентацию по отношению к мембране. Так, функционируют мембранные переносчики: связав вещество с одной стороны мембраны, они поворачиваются на 180º и высвобождают его с другой стороны.

7 – соотношение липидов и белков в мембране обычно близко к 1:1, редко от 4:1 до 1:4. Молеку­лярная масса липидов меньше массы белков приблизительно в два раза, поэтому количество липи­дов вдвое превышает количество белков. Общая толщина бислоя составляет 5,3 нм; за счет бел- ков толщина мембраны увеличивается до 7-10 нм.

8 - компоненты мембран асимметричны. Между наружным и внутренним слоем мембран имеются отличия по количеству и качеству липидов и расположению белков: одни только на наружном или в наружном слое, другие - только на внутреннем или во внутреннем слое. Углеводы находятся только на на­ружной поверхности мембран.

9 - мембраны замкнуты. Липидные бислои всегда замыкаются с образованием полностью ограниченных отсеков, изолируя гидрофобные части липидов от водной среды. При нарушении це­лостности мембран они самосливаются.

10 – мембраны являются жидкими структурами.

Биологическим мембранам клетки характерна способность взаимо- переходов друг в друга. При делении и росте клетки биологическая мембрана образуется из пузырьков аппарата Гольджи. Белки и липиды мембран синтезируется в ЭПС, дальнейшая их сортировка и модификации происходят в аппарате Гольджи; оттуда в составе транспортных пузырьков компоненты мембран направляются в различные органеллы клетки, наполняя их мембраны.

Функции биомембран обуславливаются их строением. Биомембраны выполняют следующие функции (рис.43):

а) разграничительную и барьерно-защитную – ограничивают клетку, отделяя её от межклеточной среды, а органеллы от цитоплаз­мы; обособляя клетку от межклеточной среды плазматическая мембрана защищает её от механического и химического воздействий. Кроме того, плазматическая мембрана также сохраняет разность концентраций метаболитов и неорганических ионов между внутриклеточной и внешней средой.

б) рецепторную - обеспечивают передачу межклеточных сигналов в клетку с помощью рецепторов;

в) транспортную – обеспечивают перенос веществ из внешней среды в клетку и из клетки во внешнюю среду; транспорт метаболитов и ионов, контролируемый мембранами клетки обеспечивает её гомеостаз, т.е. поддержание постоянной концентрации метаболитов и неорганических ионов, а также других физиологических параметров. Транспорт веществ осуществляется через поры и посредством переносчиков.

г) уча­ствуют в межклеточных взаимоотношениях и формируют межклеточные контакты, обеспечивая дистант­ные взаимодействия; а также контактные взаимодействия с межклеточным матриксом и другими клетками при их слиянии и образовании тканей.

д) участвуют в процессах преобразования энергии пищевых органических веществ в энергию химических связей молекул АТФ.

е) принимают участие в генерации биоэлектрических потен- циалов и проведении возбуждения – транспортные системы обеспечивают возникновение разности биоэлектрических биопотенциалов по обе стороны мембраны, а проведение возбуждения обеспечивают ионные каналы.

ж) учавствуют в клеточном метаболизме – мембраны разделяют цитоплазму на отсеки (компартменты), в которых идут разнообразные реакции обмена веществ. На мембранах локализованы ферменты. Именно здесь происходят реакции биосинтеза липидов и метаболизм неполярных ксенобиотиков. В мембранах происходят наиболее важные реакции энергетического обмена, такие, как окислительное фосфорилирование и фотосинтез.

з) заякоривание цитоскелета, обеспечивающее поддержание формы клеток и органелл и клеточной подвижности.

Рис.43. Схема функционирования мембран (Из: Интернет-ресурсы;

Биомембраны: структура и функции)