Раздел 4. Биофизика мембранных процессов

А.А. Булычев, А.А. Черкашин, А.В. Локтюшкин

Задачи по биофизике мембранных процессов основаны на применении уравнений диффузии, равновесных термодинамических соотношений, формул для стационарных ионных потоков, а также уравнений, описывающих емкостные токи и кабельные свойства мембран и волокон.

Диффузия ионов и неэлектролитов

Диффузия представляет собой спонтанное движение растворенного вещества в сторону понижения концентрации. Диффузионные законы определяют движение незаряженных веществ в объеме (на любых расстояниях при отсутствии конвекции), перенос ионов в неперемешиваемых слоях у поверхности мембран, а также движение ионов на малых расстояниях.

Формула Стокса–Эйнштейна связывает коэффициент диффузии D с температурой T, вязкостью среды η и радиусом диффундирующих частиц r (k – константа Больцмана). Например, вязкость воды при 20°С составляет η_H2O= 10^–3 Па∙с (1 Па = 1 Н/м²).

(4.1)

Пользуясь (4.1), можно оценить коэффициент диффузии в воде для малых молекул с радиусом ~0,2 нм (10^–5 см²/с) или для молекул другого размера. На движение ионов в растворе влияет электрическое поле. Коэффициент диффузии иона зависит от его заряда (z):

, (4.2)

где u – подвижность иона, имеющая размерность м²·с^–1·В^–1 (см²·с^–1·В^–1), е – заряд электрона. Например, подвижности ионов K⁺ и Na⁺ равны 7,6·10^–4 и 5,2·10^–4 см²·с^–1·В^–1, соответственно. Из (4.1) и (4.2) получаем уравнение для расчета подвижности иона по его радиусу и заряду.

(4.3)

Подвижность численно равна скорости движения ионов (см/с) при напряженности поля 1 В/см.

Законы Фика описывают скорость диффузии вещества, а также пространственное распределение концентрации диффундирующего вещества в различные моменты времени.

Первый закон Фика связывает поток вещества J с коэффициентом диффузии D и градиентом концентрации (dc/dx). Размерность потока – моль∙см^–2∙с^–1).

(4.4)

В случае диффузии через тонкую мембрану

, (4.5)

где P=D/h – проницаемость, h – толщина мембраны,  – коэффициент распределения вещества между водной и липидной фазами, а – разность концентраций диффундирующего вещества в объемных фазах по разные стороны мембраны.

Второй закон Фика описывает направление изменений концентрации вещества во времени (dc/dt) в зависимости от знака второй производной (d²c/dx²), определяющей вогнутость или выпуклость профиля концентрации по координате x:

(4.6)

Из (4.6) в частности следует, что в случае одномерной стационарной диффузии (т.е. при dc/dt=0) профиль концентрации линеен: . В общем случае одномерной диффузии пространственно-временное распределение вещества описывается нормальным распределением Гаусса:

(4.7)

где x – координата, f(x,t) – функция распределения, σ – среднеквадратичное отклонение для нормального распределения вещества относительно исходной точки при x = 0, σ² – дисперсия, а t – время. Область, расположенная между координатами ±σ, содержит более 68% от общего количества диффундирующего вещества. Согласно уравнению Эйнштейна, величина σ, обозначаемая также или ‹x›, служит мерой расстояния, на которое распространяется диффундирующее вещество за определенный промежуток времени t:

, (4.8)

где – среднеквадратичное отклонение (диффузионная длина).

Пример 4.1. После инъекции в клетку некоторого вещества до концентрации c_o, клетку отмывают средой, не содержащей этого вещества. Какое время инкубации необходимо, чтобы внутренняя концентрация вещества понизилась в 10 раз, если проницаемость мембраны для этого вещества составляет 10^–4 см/с? Решить задачу для клетки сферической формы с диаметром 200 мкм и для цилиндрической клетки с диаметром 200 мкм и длиной 1 см.

Решение: При записи первого закона Фика учтем, что диффузия происходит через тонкую мембрану и, что концентрация во внешнем растворе равна нулю.

где с – концентрация вещества в клетке в момент времени t. Зная поток вещества через мембрану и геометрию клетки (площадь поверхности S и объем V), можно выразить изменение внутренней концентрации dc за промежуток времени dt:

.

Решение этого дифференциального уравнения описывает кинетику изменения концентрации вещества внутри клетки:

, где .

Уравнение решают методом разделения переменных и интегрирования по времени от нуля до t при соответствующем изменении концентрации от c_o до c.

Для ответа на вопрос задачи удобно перейти к десятичным логарифмам:

Отношение S/V определяется геометрией клетки. Для сферы и цилиндра оно составляет соответственно

и .

С учетом условия задачи c/c_o = 0,1 и R = 0,01 см, находим искомое время t:

Аналогичный подход используется для случаев, когда в момент времени t = 0 в наружный раствор добавляют проникающее вещество, которое начинает поступать внутрь клетки, причем наружная концентрация остается постоянной (c_o = const) из-за большого объема среды по сравнению с объемом клеток. В таком опыте моменту времени t = 0 соответствует внутренняя концентрация с = 0, а произвольному моменту времени t соответствует внутренняя концентрация с. В этом случае интегрирование дифференциального уравнения приводит к следующему решению:

.

Пример 4.2. Предположим, что через калиевый канал с устьем R = 10 Å протекает ток I силой 10 пА (рис. 4.1.). При этом концентрация К⁺ в устье повышается по сравнению с объемом раствора. Найти концентрацию в области устья канала, если концентрация К⁺ в объеме составляет 10 мМ. При расчете принять, что коэффициент диффузии К⁺ в воде 10^5 см²/с.

Рис. 4.1.

Решение: На выходе из канала суммарный поток переносимых ионов диффундирует во всех направлениях, ограничиваемых полусферой. Выделим элемент поверхности полусферы и запишем поток через единицу поверхности, пользуясь первым законом Фика.

Суммарный поток вещества J связан с электрическим током I соотношением , где F – число Фарадея. Отсюда получим

, где z =1

Следовательно, перепад концентрацией между устьем канала и объемом раствора составит

Соответственно, концентрация в устье канала c_x составит 26 мМ.

Пример 4.3. Концентрация Са²⁺ в питательном растворе на расстоянии 300 мкм от поверхности корня составляет 100 мкМ, а у поверхности корня с диаметром 200 мкм – 80 мкМ. Оценить диффузионный поток Са²⁺ к поверхности корня на 1 см его длины (моль·с^–1), а также поток Са²⁺ на единицу поверхности корня (моль·см^–2·с^–1) в предположении, что коэффициент диффузии D = 5·10^–6 см²/с.

Решение: Обозначим суммарный диффузионный поток для сегмента корня длиной l символом J₀. Поток Са²⁺ направлен радиально из объема среды к центру корня. Поток через единичный участок цилиндрической поверхности неперемешиваемого слоя на расстоянии R от центра корня составит J₀/(2πRl). Запишем уравнение первого закона Фика в радиальных координатах:

Решая уравнение, находим формулу для расчета потока по концентрациям на разном удалении от центра корня (концентрации с₁ и с₂ для радиальных расстояний R₁ и R₂).

В расчете на единицу поверхности корня поток составит

.

Ионные равновесия

Представления о равновесных потенциалах для отдельных видов ионов занимают важное место в электрофизиологии животных и растительных клеток. Равновесный потенциал φ_j для вида ионов j вычисляют по формуле Нернста, которая выводится из условия равенства электрохимических потенциалов в растворах по разные стороны от мембраны, например, внутри и снаружи клетки:

, (4.9)

где и – электрические потенциалы внутри клетки и в наружной среде в условиях электрохимического равновесия, а c_o и c_i – концентрации данного иона снаружи и внутри клетки. Чем больше отклонение мембранного потенциала от равновесного потенциала, тем большая движущая сила действует на ион. Величина этого отклонения представляет собой разность электрохимических потенциалов, выраженную в единицах напряжения ( ). В линейном приближении поток пропорционален действующей силе:

, (4.10)

где I – электрический ток создаваемый потоком J ионов с валентностью z, F – число Фарадея, а g – проводимость канала или мембраны для данного вида ионов. Для многих животных клеток мембранный потенциал приближается к величине равновесного калиевого потенциала. Однако распределение ионов Na⁺ и Ca²⁺ между клеткой и средой резко отличается от равновесного. Для растительных клеток характерно неравновесное распределение ионов Ca²⁺, Cl^– и H⁺.

Термодинамические равновесные соотношения используют также для описания распределения ионов в двойном электрическом слое, величины поверхностного заряда мембран, а также распределения ионов в доннановской системе. Доннановская ячейка представляет собой термодинамически равновесную систему из двух компартментов, которые разделены мембраной, проницаемой для простых неорганических ионов но непроницаемой для крупных молекул полиэлектролитов (например, белков). Аналогичное равновесие возникает и при отсутствии мембраны, если одна из контактирующих фаз (полиэлектролитный гель или пористый материал) содержит фиксированные заряды, неспособные перейти в водный раствор. Для свободно распределяющихся ионов (как для катионов, так и для анионов) выполняется уравнение Нернста, причем в чистом водном растворе концентрации катионов и анионов одинаковы и равны с. Записав уравнение (4.9) отдельно для катионов и анионов и приравняв разность потенциалов, получим с₊ · с_– = с², где с₊ и с_– – концентрации катионов и анионов в заряженной фазе. В фазе, содержащей полиэлектролит, концентрации свободных катионов и анионов различаются, т.к. должно соблюдаться условие электронейтральности данной фазы: , где Q – общая концентрация фиксированных положительных зарядов. Объединяя приведенные формулы, получаем квадратное уравнение, которое описывает концентрацию катионов в заряженной фазе в зависимости от концентрации фиксированных зарядов Q и концентрации электролита в водной фазе:

(4.11)

Решения этого квадратного уравнения упрощаются для частных случаев с₊<<Q и c₊>>Q.

Пример 4.4. Растворы разделены мембраной, проницаемой для ионов, но непроницаемой для белка. Первый раствор содержит 30 мМ белка, молекулы которого несут заряд, равный –1, второй – 36 мМ NaCl. Определите разность потенциалов на мембране и концентрацию ионов Na⁺ и Cl^– в первом растворе (t = 27˚C).

Решение: Условие электронейтральности заряженной фазы по условию задачи имеет вид . С учетом соотношения с₊·с_–= с² получим . Решая квадратное уравнение, находим с_–.

Из двух решений годится только положительное: с_– = 24 мМ. Отсюда с₊ = 54 мМ. Разность потенциалов Δφ составит

.

Один из распространенных примеров ионного равновесия – равновесие в двойном электрическом слое. Концентрация ионов с валентностью z вблизи мембраны, несущей отрицательные фиксированные заряды, описывается уравнением Больцмана:

, (4.12)

где φ – потенциал в данной точке двойного слоя относительно потенциала в объеме раствора, а c_o – концентрация иона данного вида в объеме. Очевидно, что различия между концентрациями c_s и c_o (у поверхности мембраны и в объеме среды) возрастают с увеличением валентности иона и величины φ, зависящей от плотности фиксированных зарядов.

В теории двойного электрического слоя существует понятие длины экранирования. Длина экранирования соответствует расстоянию, при котором электрический потенциал относительно объема раствора снижается в е раз (е - основание натуральных логарифмов) по сравнению с поверхностным потенциалом. Длина экранирования обратно пропорциональна корню квадратному из концентрации электролита в растворе с:

, (4.13)

где ε – относительная диэлектрическая проницаемость воды (~81), а ε_o – абсолютная диэлектрическая проницаемость вакуума ε_o ≈ 8,85∙10^–12 Ф/м. Эта формула позволяет оценивать толщину двойного электрического слоя при разных концентрациях электролита в растворе.

Связь между плотностью фиксированных зарядов на мембране, поверхностным потенциалом и концентрацией электролита в растворе описывается уравнением Гуи–Чапмена:

, (4.14)

где ψ=Fφ/(RT) – поверхностный потенциал в безразмерных единицах, sh – функция гиперболический синус ( ), а z = 1 для бинарных электролитов типа NaCl и z = 2 для солей типа СаSO₄. В случае малых потенциалов shx ≈ x. В этом случае можно считать, что поверхностный потенциал мембраны пропорционален плотности фиксированных зарядов и обратно пропорционален корню квадратному из концентрации электролита:

. (4.15)

Одно из важных предположений в теории Гуи–Чапмена состоит в том, что плотность фиксированных зарядов σ не зависит от концентрации электролита в окружающем мембрану растворе. Это допущение оправдано лишь в случаях низкой константы связывания ионов с мембраной или же низкой концентрации электролита. Система уравнений, включающая (4.14) и учитывающая изменения σ при связывании ионов с мембраной, существенно расширяет область применения теории двойного слоя Гуи–Чапмена. Связывание катионов М⁺ с мембраной можно рассматривать как их обратимое взаимодействие с фиксированными отрицательными зарядами A^– с константой связывания K: . Заряд σ при таком связывании снижается

(4.16)

где А^– и АM связаны соотношением

. (4.17)

Концентрация [M⁺]_s на границе с мембраной отличается от объемной концентрации [M⁺].

Поверхностный заряд и поверхностный потенциал играют важную роль в биологических процессах. Электростатическое притяжение протонов к фиксированным отрицательным зарядам мембраны вызывает локальное понижение рН у поверхности мембраны по сравнению с рН в объеме раствора. Поскольку рН у поверхности отличается от объемного значения, истинные константы диссоциации ионизируемых групп не совпадают с кажущимися константами. Наличие поверхностного заряда влияет на скорость окислительно-восстановительных процессов, протекающих с участием заряженных редокс медиаторов. Значения поверхностного, а также дипольного потенциала определяют высоту электростатического барьера, преодолеваемого ионами при прохождении через мембраны, и, следовательно, существенно влияют на проводимость мембран. Разность поверхностных потенциалов для двух сторон мембраны может создавать внутримембранное электрическое поле, которое оказывает влияние на процессы прямого и обратного переноса электронов в реакционных центрах фотосинтетических мембран, на степень активации ионных каналов, электростатическое сжатие мембраны и устойчивость мембран к электрическому пробою. Поверхностные потенциалы являются одним из основных факторов, определяющих равновесное расстояние между параллельно ориентированными мембранами (стыковка и расхождение тилакоидов в хлоропластах).

Пример 4.5. При добавлении 0,1 M KCl к тилакоидам, находящимся в бессолевой среде, наблюдали такие же изменения светорассеяния препаратов, как и при добавлении 0,01 М MgSO₄. Пользуясь теорией двойного электрического слоя оценить плотность поверхностных зарядов на тилакоидной мембране и величину поверхностного потенциала, создаваемого при указанных воздействиях.

Решение: Одинаковый уровень светорассеяния препаратов в средах с KCl и MgSO₄ свидетельствует об одинаковой упаковке тилакоидов в гранах, что достигается при равенстве поверхностных потенциалов для двух указанных воздействий. Согласно теории Гуи–Чапмена, плотность поверхностных зарядов  постоянна и при постоянном рН не зависит от природы электролита. Из условия задачи следует, что ₁ = ₂, где ₁ и ₂ – поверхностные потенциалы, создаваемые в присутствии солей одновалентных и двухвалентных ионов (KCl и MgSO₄, соответственно). Запишем формулу (4.14) для каждого из этих электролитов и приравняем значения , а также учтем, что ₁ = ₂ = . Получим

, где ψ=Fφ/(RT), а с₁ и с₂ – концентрации солей одно- и двухвалентных ионов. Функцию sh ψ в правой части можно представить как разность квадратов и сократить на sh ψ/2. При этом получим

;

≈ 2,06; φ ≈ 2,06∙25 мВ = 51,6 мВ. Знак поверхностного потенциала – отрицателен в соответствии с отрицательным знаком σ. Пользуясь (4.14), рассчитаем σ:

При проведении расчетов можно избежать применения прямых и обратных гиперболических функций. Для этого необходимо провести математическое преобразование, пользуясь соотношением . В этом случае и уравнение (4.14) приобретает вид .

Рассмотренный метод определения σ известен как метод изоэффективных концентраций одно- и двухвалентных ионов.

Пример 4.6. Предположим, что в изолированных хлоропластах, помещенных в 0,01 М раствор KCl, расстояние между тилакоидными мембранами в гранах составляет h = 10 нм. Найти избыточную концентрацию ионов в зазоре между мембранами (по сравнению с концентрацией в среде) при условии, что отрицательный поверхностный заряд мембран σ составляет 20 мКл/м².

Решение: В объеме между мембранами, несущими отрицательный фиксированный заряд, накапливается избыток свободных катионов, а анионы, напротив, исключаются из этого объема. Для того чтобы оценить содержание свободных катионов и анионов, необходимо знать величину электрического потенциала по центру расстояния между мембранами φ*. В промежутке между мембранами электрический потенциал меняется немонотонно по координате x, достигая минимума по абсолютной величине (φ*) по середине межмембранного зазора. Для одиночной мембраны в случае небольших потенциалов (приближение Дебая) абсолютная величина потенциала в двойном электрическом слое убывает экспоненциально с увеличением расстояния от границы: , где φ_s – поверхностный потенциал, а λ – длина экранирования, описываемая уравнением (4.13). В случае двух параллельно расположенных мембран распределение потенциала φ в зазоре включает две симметричные ветви и описывается суммой убывающей и нарастающей экспонент: Из соображений симметрии за ноль координаты x удобно принять середину зазора между мембранами. В этой точке (при х = 0) потенциал минимален и составляет 2φ_о=φ*. На расстояниях х = ±h/2 значения потенциала равны потенциалу поверхности φ_s, т.е. Условия задачи позволяют рассчитать длину экранирования по формуле (4.13), а также величину поверхностного потенциала φ_s по формуле (4.15). Избыточная концентрация ионов (К⁺ и Cl^–) по центру межмембранного зазора по сравнению с концентрацией ионов в окружающей среде запишется в виде:

Длина экранирования для 0,01 М раствора KCl при T = 300 K равна по уравнению (4.13):

.

Поверхностный потенциал можно рассчитать по (4.15) или же воспользоваться равноценными представлениями о двойном слое как конденсаторе с зарядом на пластинах, равном σ, потенциалом φ_s и толщиной диэлектрического слоя λ. В последнем случае выполняется соотношение

где – емкость двойного электрического слоя.

.

Потенциал φ* по центру между мембранами составит

.

Избыточная концентрация осмотически активных частиц (ионов) по середине промежутка между мембранами составит

осмоль/л

Следует отметить, что избыток ионов в промежутке между мембранами создает избыточное осмотическое давление, которое рассчитывают по уравнению Вант-Гоффа

.

Трансмембранные потоки ионов

Пассивное движение ионов через мембраны (без участия активных транспортных систем) происходит при наличии движущей силы – градиента электрохимического потенциала. Согласно основному уравнению электродиффузионной теории, ионный поток пропорционален движущей силе: , где c – концентрация иона в данной области, u – подвижность иона в данной среде, а – градиент электрохимического потенциала для данного вида ионов. Трансмембранный градиент электрохимического потенциала для ионов j представляют в виде:

(4.18)

где φ = φ₂ – φ₁ – мембранный потенциал, а – равновесный потенциал для данного вида ионов. Выражение характеризует движущую силу транспорта. Поток ионов J создает электрический ток I: . Коэффициент пропорциональности между величиной тока и действующей силой представляет собой проводимость g:

(4.19).

В случае идентичного состава растворов с обеих сторон мембраны, проводимость для иона j равна:

, (4.20)

где Р_j – проницаемость мембраны для данного вида ионов, с – концентрация ионов, а φ – мембранный потенциал. Формула (4.20) описывает зависимость проводимости от концентрации проникающего электролита и проницаемости мембраны. Она не применима для описания изменений проводимости, связанных с переходами каналов между открытым и закрытым состояниями.

Для описания изменений проводимости потенциал-зависимых ионных каналов удобна кинетическая модель с двумя состояниями (закрытым и открытым), переходы между которыми зависят от мембранного потенциала с константами a и b , .

В данной модели зависимость числа открытых состояний N_o от потенциала описывается сигмоидной (больцмановской) кривой

, (4.21)

где N – общее число каналов, K_o = b_o/a_o – константа равновесия для переходов между двумя состояниями каналов при отсутствии мембранного потенциала, а ψ=φF/(RT) – мембранный потенциал в единицах RT/F (≈ 25 мВ при 20˚С).

Величина тока в системе потенциал-зависимых каналов определяется произведением общего числа каналов N, вероятности открытого состояния p=No/N, а также тока через одиночный канал i: , где i = g(φ – φ_o) – ток одиночного канала. Из уравнений (4.19, 4.21) видно, что изменения мембранного потенциала оказывают влияние как на движущую силу, так и на проводимость каналов. Поэтому, зависимость тока от напряжения на мембране в системе управляемых потенциалом каналов проявляет существенную нелинейность и может включать участок отрицательного наклона.

Участок с отрицательным наклоном характерен для возбудимых мембран. Такая вольт-амперная характеристика (ВАХ) появляется при условии, что область изменений проводимости g(φ), определяемая уравнением (4.21), сдвинута в сторону более отрицательных потенциалов по сравнению с равновесным потенциалом φ_o для данного вида ионов. Поэтому ВАХ для тока натриевых каналов (φ_o ~ +50 мВ) включает участок отрицательного сопротивления, а ВАХ для тока калиевых каналов в обычных условиях (φ_o < –100 мВ) не содержит участка отрицательного наклона.

Пример 4.7. Изобразить зависимость тока через Na канал от мембранного потенциала в интервале от –100 до 100 мВ при условии, что канал с проводимостью 5 пСм открывается при деполяризации мембраны до уровня φ > –50 мВ, а наружная и внутренняя концентрации Nа⁺ составляют соответственно 145 и 12 мМ. Температура 37°С.

Решение: В области –100 до –50 мВ канал закрыт, ток равен нулю. В области от –50 до 100 мВ зависимость линейна i = g(φ – φ_o), где φ_o=(RT/F)·ln(c_o/c_i)= 66,5 мВ. Положительные значения тока при φ > φ_o соответствуют выходящему направлению (из клетки в среду), а отрицательные токи при φ < φ_o соответствуют входящему току. При потенциале φ = 0 величина Na⁺-тока составит i ≈ 5·10^–12 См·(–0,067 В) ≈ -0,33 пА. При потенциале открывания канала φ = –50 мВ, i ≈ 5·10^–12·(–0,05–0,067) ≈ -0,585 пА.

Суммарный ток, протекающий через мембраны, включает емкостную составляющую и ионный ток, состоящий из токов отдельных видов ионов: , где I_l – ток утечки, для которого характерна линейная зависимость от напряжения на мембране. В физиологических условиях суммарный ток не выводится во внешнюю измерительную цепь и (при разомкнутой внешней цепи) равен нулю. В этих условиях ионный ток равен по абсолютной величине емкостному току.

(4.22)

Из (4.22) видно, что перенос ионов через мембрану вызывает изменение потенциала на мембране, представляющей диэлектрический слой (конденсатор) с емкостью С_m. В случае переноса определенного количества зарядов ΔQ (ΔQ = ∫I·dt) изменение напряжения Δφ составит:

(4.23)

Эта формула позволяет оценить мембранный потенциал, создаваемый при переносе известного количества зарядов, или же оценить минимально необходимый ионный поток сдвигающий напряжение на мембране в период потенциала действия. По данным о количестве перенесенных зарядов можно оценить изменения ионных концентраций.

Пример 4.8. Найти минимальное количество n молей Сa²⁺, которое необходимо перенести через поверхность мембраны нейрона (в расчете на 1 см²) для генерации потенциала действия с амплитудой 100 мВ. Емкость мембраны С_m = 1 мкФ/см². Насколько изменится внутриклеточная [Сa²⁺] при переносе найденного количества Са²⁺ во время потенциала действия в нейроне диаметром 50 мкм? При расчете допустить, что клетка – сферическая, а внутриклеточный уровень [Са²⁺] в покое составляет 100 нМ.

Решение: Найдем заряд, который необходимо перенести через мембрану, чтобы сдвинуть потенциал на 100 мВ: Кл/см². Пересчитаем количество перенесенных зарядов на соответствующее количество молей вещества (z = 2) моль/см². Изменение концентрации внутри клетки при переносе внутрь количества Са²⁺, равного n, составит , где (см пример 4.1): М. Расчет показывает, что поток Са²⁺ во время потенциала действия вызывает многократное повышение исходного уровня Са²⁺.

Как видно из (4.22), емкость мембраны определяет скорость изменения мембранного потенциала за счет движения ионов по градиенту электрохимического потенциала. При подключении заряженного конденсатора C к резистору R в аналоговой модели мембраны, напряжение на конденсаторе снижается экспоненциально с постоянной времени τ = RC:

. (4.24)

Поскольку удельная емкость биологических мембран С_m не претерпевает существенных изменений и составляет по разным оценкам от 0,5 до 1,0 мкФ/см², анализ кинетики релаксации мембранного потенциала хлоропластов после короткой заряжающей мембрану вспышки света позволяют оценить проводимость тилакоидных мембран в различных условиях (на свету и в темноте, при действии мембрано-активных агентов, при разных концентрациях ионов в среде):

(4.25)

Размерность правой части (4.25) – сименс: [Ф/с] = [Кл/(В с)] = [А/В] = [Ом^–1] = [См]. Во многих случаях размерности g и C отнесены к единице площади мембраны [Ф/см²] и [См/см²]. Сочетание (4.20) и (4.25) позволяет иногда оценивать проницаемость мембран по измерениям τ.

Пример 4.9. В приближении постоянного поля оценить удельные значения проводимости и сопротивления тилакоидной мембраны хлоропласта, окруженной растворами с одинаковым содержанием KCl (0,1 М), при условии, что основной вклад в проводимость связан с высокой проницаемостью мембран для К⁺ (Р_К = 4·10^8 см/с). Какова постоянная времени мембраны , если удельная емкость мембраны составляет 1 мкФ/см²?

Решение: Проводимость мембраны оценивают по формуле (4.20), а емкость – по (4.25):

Пример 4.10. При измерениях кинетики спада индуцируемого вспышкой мембранного потенциала Δφ в тилакоидах хлоропластов найдено, что постоянная времени τ экспоненциальной кривой составляет после темновой адаптации хлоропластов 100 мс, а после предварительного освещения – 50 мс. В присутствии ингибитора Н⁺-АТФазы предварительное освещение хлоропластов не вызывало ускорения спада Δφ. Исходя из допущения, что снижение τ после предварительного освещения обусловлено активацией проводимости сопрягающего фактора CF₁-CF₀, оценить проводимость одиночного канала Н⁺-АТФазы и стационарный поток Н⁺ через одиночный канал при ΔрН ~ 3,3. Плотность расположения Н⁺-АТФаз в мембране тилакоидов составляет 0,2∙10^–13 моль/см².

Решение: Приращение проводимости, связанное по условию задачи с подключением на свету каналов Н⁺-АТФазы, составит:

Проводимость одиночного канала Н⁺-АТФазы находим с учетом плотности расположения АТФаз и числа Авогадро (~6·10²³):

.

Для оценки потока протонов выразим протондвижущую силу в единицах напряжения:

.

Ток через одиночный канал составит , а количество переносимых H⁺ составит . При стехиометрическом соотношении H⁺/АТФ = 3, поток H⁺ соответствует скорости синтеза АТФ ~ 400 c^–1 на один комплекс, что соответствует времени оборота фермента ~1/400 = 2,5 мс.

Кабельные свойства волокон

Механизм распространения потенциала действия по нервному волокну включает стадию электротонического распределения потенциала, аналогичного распределению потенциала в электрическом кабеле. Если один из участков аксона деполяризован, возникают локальные токи, которые вызывают деполяризацию соседних участков и смещают потенциал в сторону достижения порогового уровня. Распространение токов описывается кабельным уравнением. Продольный ток описывается законом Ома: , где dφ/dx – разность потенциалов на единицу длины волокна, а R_c´ – сопротивление цитоплазмы на единицу длины волокна. В стационарном состоянии емкостной ток через мембрану равен нулю (I_C = C_m·d/dt = 0). В этих условиях трансмембранный ток на участке аксона длиной dx равен убыли продольного тока на этом же участке: φ/R_m´= dI_l/dx, где R_m´ – сопротивление мембраны на единицу длины волокна:

(4.26)

Решение уравнения имеет вид

, где (4.27)

Значения R_m´ и R_c´ зависят от геометрических параметров волокна. Чем шире сечение волокна, тем ниже сопротивление цитоплазмы и тем больше площадь мембранной поверхности в расчете на единицу длины волокна. С увеличением длины сегмента волокна сопротивление столба цитоплазмы возрастает, а сопротивление окружающей его мембраны, напротив, снижается (т.к. поверхность мембраны увеличивается). Поэтому размерности R_m´ и R_c´ существенно различаются.

Сопротивление проводника с сечением S и длиной l описывается «школьной» формулой . Сопротивление проводника (столба аксоплазмы) на единицу длины равно , где r – радиус волокна. Из приведенной формулы видно, что R_c´ имеет размерность Ом/см.

Сопротивление мембраны также подчиняется формуле , где ρ – удельное сопротивление материала мембраны, l – толщина мембраны, а S – площадь её поверхности. Поскольку толщина мембраны постоянна, произведение обозначают R_m и называют удельным сопротивлением мембраны, т.е. . В случае волокна цилиндрической формы поверхность мембраны , а сопротивление мембраны для участка произвольной длины равно . Сопротивление мембраны в расчете на единицу длины составит . Отсюда видно, что R_m´ имеет размерность Ом·см, а размерность λ в (4.27) – сантиметры.

Суммируя промежуточные результаты, можем записать

(4.28)

При подстановке (4.28) в (4.27) находим, что константа длины λ возрастает с увеличением удельного сопротивления мембраны и с понижением сопротивления аксоплазмы, а также возрастает пропорционально корню квадратному из радиуса волокна:

(4.29)

Пример 4.11. Удельное сопротивление плазматической мембраны R_m длинной цилиндрической клетки (волокна) составляет 30 кОм·см², а удельное сопротивление внутренней среды  = 1 кОм·см. Оценить постоянную длины волокна  для клетки с диаметром d (а) 1 мм и (б) 100 мкм.

Решение: Используя соотношения (4.26-4.28), находим значения константы длины λ:

; λ₂ = 0,27 см

Электрохимические градиенты и преобразование энергии

Поддержание ионных градиентов на мембране позволяет совершать различные виды работы. Простейший пример – осмотическое поднятие воды за счет потока растворителя через полупроницаемую мембрану. Высота, на которую можно поднять жидкость, определяется разностью осмотических давлений между разделенными мембраной растворами. Осмотическое давление в случае, когда активности ионов или растворенных неэлектролитов примерно равны концентрациям (коэффициент активности близок к единице) выражается уравнением Вант-Гоффа

. (4.30)

Пример 4.12. Оценить максимальную высоту поднятия воды в трубке, которая заполнена 0,01 М раствором KCl и отделена полупроницаемой мембраной от отсека с водой.

Решение: Пренебрегая отличиями активности ионов от концентраций, будем считать, что концентрация осмотически активных частиц (сумма катионов и анионов) равна 0,02 М. В условиях равновесия в осмотической ячейке, давление столба жидкости (отношение веса жидкости в трубке к площади сечения) равно осмотическому давлению: . Отсюда

Один из механизмов вертикального подъема жидкости основан на молекулярных взаимодействиях, проявляющихся в виде поверхностного натяжения жидкости. Например, при погружении стеклянного капилляра воду, вода поднимается на различную высоту в зависимости от диаметра капилляра.

Пример 4.13. Найти высоту капиллярного поднятия воды в стеклянном капилляре радиусом 100 мкм. Угол смачивания (угол θ между мениском и стеклом) в случае воды равен нулю.

Решение: Сила, поднимающая воду в капилляре, равна ,

где σ – поверхностное натяжение (для воды Н/м), l – периметр мениска, а r – радиус капилляра. В условиях равновесия эта сила равна весу водного столба.

. Из условия равенства сил получим

(4.31)

В биоэнергетике большую роль играет электрохимический градиент протонов, энергия которого используется для синтеза АТФ, выведения из клетки избытка ионов Na⁺ (что особенно важно для галотолерантных микроорганизмов) или вращения жгутиков. Электрохимический градиент протонов включает химическую и электрическую составляющие:

, (4.32)

где ΔpH = pH_o – pH_i, а Δφ = φ_i – φ_o. Из (4.32) видно, что выражается в Дж/моль.

Вместе с тем, электрохимический градиент протонов можно выразить в единицах напряжения или единицах рН:

, (В)

, (ед. рН).

Пример 4.14. Оценить ЭДС АТР-зависимого Н⁺-насоса плазматической мембраны растительной клетки, т.е. максимально возможную разность потенциалов между цитоплазмой и средой (_i  _o), на основе термодинамических равновесных соотношений (энергия гидролиза АТP используется на транспорт Н⁺ из цитоплазмы в среду против ). При расчете принять, что H⁺/ATP = 1 (для переноса одного протона используется энергия одной молекулы АТР), G˚_ATP (стандартное изменение свободной энергии при гидролизе АТР)  40 кДж/моль, отношение ATP/ADP в цитоплазме равно 10, [P_i] = 10 мМ, а значения рН среды (рН_о) и цитоплазмы (рН_i) составляют 6 и 8 ед. соответственно.

Решение:Запишем уравнение для сопряженных процессов гидролиза АТР и переноса протонов из цитоплазмы в среду:

ATP + H⁺_i = ADP + P_i + H⁺_o,

где H⁺_i и H⁺_o – протоны в цитоплазме и среде, соответственно.

Изменение термодинамического потенциала в ходе процесса будем считать равным нулю

.

Понижение энергии Гиббса в ходе гидролиза АТР компенсируется равным по величине возрастанием энергии при переносе протонов для поддержания .

Из полученного выражения можно найти максимальную разность потенциалов :

ЗАДАЧИ

4.1. Найдите среднюю величину смещения ‹x› молекулы формамида в воде и в растворе сахарозы за 1 мин, если коэффициенты диффузии этого вещества в воде и сахаразе составляют соответственно 1,6·10^–5 и 0,3·10^–5 см²/с.

4.2. Определите коэффициент диффузии эритрита в воде, если средняя величина смещения его молекулы составляет 40 мкм за 1 с.

4.3. Чему равен поток формамида через мембрану толщиной 8 нм, если коэффициент диффузии составляет 1,4·10^–8 см²/с, концентрация по одну из сторон мембраны равна 2·10^–4 М, а по другую сторону мембраны – в десять раз меньше?

4.4. Бислойная липидная мембрана (БЛМ) толщиной 10 нм разделяет два отсека, содержащих растворы метиленового синего в концентрациях 10^–2 и 2·10^–3 М. По изменениям окраски одного из растворов установлено, что поток красителя через БЛМ равен 3·10^–7 моль∙см^–2∙с^–1. Определите коэффициент диффузии метиленового синего в мембране.

4.5. Найдите коэффициент проницаемости плазматической мембраны для формамида, если разность концентраций этого вещества по разные стороны мембраны составляет 0,05 М, а поток через мембрану – 2,4·10^–8 моль·см^–2 с^–1.

4.6. Рассчитайте характерную толщину двойного электрического слоя для растворов NaCl с концентрациями 10^–5 и 10^–3 М.

4.7. Мембрана с плотностью отрицательных поверхностных зарядов 40 мКл/м² с каждой стороны окружена растворами KCl с концентрацией 10^–3 и 10^–1 М. Оценить внутримембранную разность потенциалов, создаваемую за счет разности поверхностных потенциалов.

4.8. Поверхностный потенциал мембраны равен –35 мВ. Найти рH у поверхности мембраны при условии, что рН в объеме среды составляет 7,6.

4.9. Во сколько раз отличается концентрация La³⁺ у поверхности заряженной мембраны от концентрации в растворе, если поверхностный потенциал составляет –30 мВ?

4.10. На поверхности мембраны протекает редокс реакция с участием заряженного редокс медиатора (акцептор А⁺) с валентностью z = +1 и находящегося в мембране донора D. Во сколько раз отличается истинная скорость реакции при высокой концентрации электролита (при φ_s = 0) от скорости реакции при φ_s = –25 мВ.

4.11. Оценить, насколько отличается плотность фиксированных зарядов  от максимального значения _max для мембран из фосфатидилхолина при условии, что (а) среда содержит 10 мМ MgSO₄, _s = 12,5 мВ, а константа связывания Mg²⁺ с мембранами составляет 1 М^1, (б) среда содержит 10 мМ CaSO₄, _s = 25 мВ, а константа связывания Ca²⁺ с мембранами составляет 100 М^1.

4.12. В суспензию митохондрий добавлены одновалентные проникающие катионы и анионы до концентрации с_о = 10 мкМ. Оценить изменения концентрации катионного и анионного зондов в наружной среде при генерации в митохондриях мембранного потенциала –116 мВ при условии, что отношение объемов среды и митохондрий составляет V_o/V_i = 5·10³. Принять, что изменения наружной концентрации проникающих ионов обусловлены только их распределением в соответствии с мембранным потенциалом.

4.13. Изобразить зависимость тока I через K⁺-канал от мембранного потенциала _m в интервале от –100 до 100 мВ при условии, что канал с проводимостью 20 пСм открывается при _m > –50 мВ, а наружная и внутренняя концентрации K⁺ составляют соответственно 4 и 155 мМ. Отметить значения тока при _m = 0. Температура 37˚С. Отметить положение точек пересечения графика с осями, если такие точки имеются.

4.14. Изобразить зависимость тока через Cl^--канал от мембранного потенциала _m в интервале от –150 до 150 мВ при условии, что канал с проводимостью 10 пСм открывается при _m > –50 мВ, а наружная и внутренняя концентрации Cl^– составляют соответственно 123 мМ и 4,2 мМ. Температура 37˚С.

4.15. Рассчитать равновесный потенциал для ионов Са²⁺ в мышечных волокнах млекопитающих при условии, что наружная концентрация Са²⁺ составляет 1,5 мМ, а внутренняя – 100 нМ.

4.16. Найти минимальное количество молей Na⁺, переносимого через 1 см² поверхности возбудимой мембраны, которое достаточно для генерации потенциала действия с амплитудой 100 мВ. Емкость мембраны принять равной 1 мкФ/см². Насколько изменится внутриклеточная концентрация Na⁺ во время потенциала действия в аксоне диаметром 500 мкм? В покое [Na⁺]_i= 10 мМ.

4.17. Рассчитать разность потенциалов Δφ, создаваемую на тилакоидной мембране при переносе одного электрона по ЭТЦ в ответ на короткую вспышку, если известно, что площадь участка S, занимаемого одной ЭТЦ, составляет 1,45·10^–11 см², а удельная емкость мембраны C_m = 0,5 мкФ/см². Примечание: площадь мембраны в расчете на одну ЭТЦ определена из данных о поверхности тилакоидных мембран – 1,75 м²/мг хлорофилла (1 мг ~10^–6 М Хл) и относительном содержании хлорофилла Р700 (Р700 : Хл = 1: 500). Плотность ЭТЦ в мембране составит 1,14^–13 моль Р700 на 1 см², а площадь S на одну ЭТЦ (1 молекула Р700) – 1,45·10^–11 см².

4.18. Рассчитать характерное время экспоненциального спада потенциала тилакоидной мембраны после световой вспышки в хлоропластах, обработанных валиномицином в среде с 0,1 М KCl, если проницаемость в присутствии ионофора составляет P_K = 4·10^–7 см/с, а C_m = 0,5 мкФ/см²

4.19. Какое количество одновалентных катионов в секунду проходит через неселективный канал, образованный антибиотиком аламетицином, если его проводимость g составляет 5 нСм, а потенциал на мембране ∆φ = 128 мВ?

4.20. Определите постоянную времени и характеристическую длину гигантского аксона кальмара, если удельное сопротивление аксоплазмы составляет 314 Ом·см, емкость и сопротивление мембраны – 1,1 мкФ/см² и 1570 Ом·см² соответственно, а диаметр аксона – 500 мкм.

4.21. Определите постоянную времени и характеристическую длину нервного волокна омара, если удельное сопротивление аксоплазмы составляет 173 Ом·см, емкость и сопротивление мембраны – 1,3 мкФ/см² и 2360 Ом·см² соответственно, а диаметр волокна – 75 мкм.

4.22. Определите постоянную времени и характеристическую длину мышечного волокна лягушки, если удельное сопротивление цитоплазмы составляет 418 Ом·см, емкость и сопротивление мембраны – 5 мкФ/см² и 4500 Ом·см², соответственно, а диаметр волокна – 45 мкм.

4.23. Две стеклянные пластинки, каждая шириной l расположены параллельно друг другу с зазором d = 0,2 мм. Если они вертикально погружены в воду при 20С, на какую высоту h над поверхностью поднимется вода между пластинами? Поверхностное натяжение воды  = 0,0728 Н/м. Краевой угол смачивания θ = 0.

4.24. Пластины плоского конденсатора погружены в воду. К пластинам прикладывают напряжение . Замена воздуха на воду между пластинами приводит к понижению энергии системы. Поэтому вода втягивается в зазор до высоты h. Оценить высоту подъема воды при условии, что зазор d составляет 0,1 мм, а напряжение  = 100 В. Электрическую силу подъема воды можно найти как где W =С²/2 – энергия заряженного конденсатора.

4.25. Определить разность электрохимических потенциалов на тилакоидной мембране хлоропласта для стационарного состояния, когда ΔрН = 3, а трансмембранный электрический потенциал Δφ равен 30 мВ.

4.26. Рассчитать величину ΔрH, создаваемого на тилакоидной мембране при действии короткой вспышки (перенос одного электрона по ЭТЦ), если известно, что буферная емкость тилакоидов составляет 0,18 моль Н⁺ на моль хлорофилла (Хл), а на одну ЭТЦ (на одну молекулу Хл Р700) приходится 500 молекул Хл.

4.27. Какое соотношение концентраций АТР/ADP может быть достигнуто в суспензии освещенных хлоропластов за счет ΔрН, равного 3 ед., и электрического потенциала Δφ = 20 мВ при концентрации фосфата в среде 10 мМ. Стандартное изменение термодинамического потенциала ΔG˚_ATP при синтезе ATP принять равным 32 кДж/моль, а стехиометрическое отношение n = Н⁺/АТР = 3.

4.28. Определить уровень на тилакоидной мембране освещенных изолированных хлоропластов, необходимый, чтобы отношение [ATP]/([АDP][P]) достигло значения 30000 M^–1. Принять, что отношение H⁺/АТР равно трем (n = 3), ΔG^°_ATP = 32 кДж/моль, а t = 25°C. Найти соответствующий уровень ΔpH, если Δφ = 30 мВ.

4.29. Транспорт воды через полупроницаемые мембраны (проницаемые только для воды, но не для растворенных веществ) при наличии на мембране разности осмотического давления описывается уравнением

.

Здесь J_V – объемный поток воды (объем воды, переносимый через единицу площади мембраны в единицу времени ), ∆π – разность осмотического давления на мембране, = 18 см³/моль – мольный объем воды, L_P – гидравлическая проводимость мембраны и P_f – коэффициент осмотической водной проницаемости мембраны.

Суспензию эритроцитов в 250 мМ растворе сахарозы быстро смешали с более концентрированным раствором. Концентрация сахарозы после смешивания стала равной 350 мМ. Определить гидравлическую проводимость L_P и коэффициент осмотической водной проницаемости мембраны эритроцита P_f при 37˚С, если через 700 мс после смешивания объем клеток уменьшился на 20%. Изменением концентрации сахарозы во внешнем растворе и площади поверхности эритроцита пренебречь. Отношение площади поверхности эритроцита начальному объему принять равным 13500 см⁻¹. Сахароза через мембрану эритроцитов не проникает.

4.30. Цианиновые красители используются как флуоресцентные зонды для определения мембранного потенциала клеток. Молекулы цианиновых красителей заряжены положительно и накапливаются в цитоплазме клеток при отрицательном мембранном потенциале. Накопление красителя в цитоплазме приводит к концентрационному тушению флуоресценции. Таким образом, создание положительного потенциала внутри приводит к усилению флуоресценции, а отрицательного – к ее тушению.

Для определения мембранного потенциала эритроцитов к суспензии клеток добавили цианиновый флуоресцентный зонд diS-C₃-(5). После установления стационарного уровня флуоресценции к суспензии эритроцитов добавили ионофор валиномицин, значительно повышающий проницаемость мембраны для ионов K⁺. Если среда, в которой находились клетки, содержала 102 мМ K⁺, то после добавления валиномицина интенсивность флуоресценции не менялась. Если среда содержала 153 мМ K⁺, флуоресценция возрастала, а если 51 или 0 мМ K⁺ – она убывала. Определить величину потенциала на эритроцитарной мембране до добавления ионофора при 37˚С, если в цитоплазме концентрация K⁺ равна 153 мМ. В отсутствие валиномицина мембрана эритроцитов плохо проницаема для катионов.

4.31. Ионофор нигерицин переносит через мембрану один ион K⁺ в обмен на один ион H⁺. Нигерицин используют, чтобы уравнять величину pH в цитозоле клеток и во внешней среде. Для этого клетки помещают в среду, где концентрация ионов K⁺ равна концентрации этих ионов в цитозоле клеток и добавляют ионофор. Показать, что в этой системе после установления равновесия величина pH цитозоля сравняется с величиной pH среды. Какой будет разница величин pH цитозоля и внешней среды после добавления нигерицина, если концентрация K⁺ в среде будет в 10 раз меньше концентрации в цитозоле?

4.32. Na⁺/K⁺-АТФаза – фермент, который осуществляет активный транспорт одновалентных катионов через клеточную мембрану. За один цикл работы фермента из клетки выводится три иона Na⁺ в обмен на два иона K⁺. В стационарном состоянии поток иона, создаваемый ферментом полностью компенсируются пассивным потоком утечки, обусловленным мембранной проницаемостью. Используя приближение постоянного поля для токов утечки, показать, что стационарный потенциал, возникающий на мембране при работе Na⁺/K⁺-АТФазы, можно рассчитать с помощью уравнения Томаса:

где P_K и P_Na – проницаемость мембраны для ионов K⁺ и Na⁺ соответственно, κ = 3/2. Индексы in и out относятся к цитоплазме и внешней среде.