Раздел 6. Седиментационное равновесие и центрифугирование.

Д.В. Зленко

Введение

Рассмотрим частицу, находящуюся в жидкой среде под действием силы тяжести после установления равновесия. На такую частицу действуют две силы: сила тяжести mg и сила трения f_тр. В равновесии эти силы равны по величине и направлены в противоположные стороны. Используя выражение, описывающее трение в жидкой среде (формулу Стокса), для сферической частицы имеем:

mg = f_тр = 6πηRv,

где m – масса частицы, η – вязкость среды, R – радиус частицы и v – скорость частицы. Кроме того, необходимо учесть Архимедову силу, так же препятствующую оседанию частицы:

(ρ_част – ρ_раств)Vg = 6πηRv, (6.1)

где V – объём частицы, а ρ – плотность. Соответственно, частица будет тонуть (седиментировать) или всплывать (флотировать) в зависимости от соотношения плотностей.

Теперь рассмотрим случай, когда сила тяжести дополнена центробежной силой (самой силой тяжести пренебрежём, т.к. нас будут интересовать центробежные силы, значительно превосходящие по величине mg). В этом случае Архимедова сила и сила, действующая на частицу, будут пропорциональны ω²l, где l – расстояние до центра вращения, а ω – угловая скорость в радианах:

F_а = Vρ_раствω²l,

F_действ = Vρ_частω²l.

Запишем уравнение, описывающее движение частицы

ω²l = 6πηRv. (6.2)

Введём обозначение S = v / ω²l, S называется коэффициентом седиментации, т.е. отношением скорости оседания к действующему ускорению. Формально коэффициент седиментации измеряется в секундах, но в литературе принято обозначение «Сведберг» или S (1S=10^-13 сек). Таким образом, для сферической частицы:

. (6.3)

Зная коэффициент седиментации, можно примерно оценить массу оседающей частицы. Для этого выразим радиус частицы из полученного уравнения

. (6.4)

Выражение для массы частицы примет следующий вид

. (6.5)

Соответственно, молярная масса частиц в системе единиц СИ

Приведенное выше рассмотрение процесса седиментации является упрощённым, в реальных условиях частицы практически не бывают сферическими, на процесс оседания влияют диффузионные явления и гидратация. Для случая несферических частиц обычно вводят поправки к коэффициенту вязкого трения (см. доп. литературу), диффузионные процессы сильно усложняют уравнения и не будут рассмотрены. Влияние гидратации макромолекул на их седиментацию может быть рассмотрено следующим образом. Предположим, что в среднем каждая макромолекула связала 10% воды по массе (т.е. степень гидратации δ = 0,1) – это означает, что эффективная масса выросла на 10%, вырос и радиус эффективной частицы примерно как , а эффективная плотность снизилась (при условии, что частица седиментировала). Исходя из этих соображений, следует модифицировать исходные данные о плотности макромолекул и провести расчеты. Затем следует вычесть из полученной молярной массы вклад гидратной оболочки.

Пример 6.1. Медный шарик (r = 1 см) тонет в глицерине (ρ = 1,26 г/см³) под действием силы тяжести, определить стационарную скорость оседания. Во сколько раз быстрее оседает медный шарик, движущийся равномерно под действием центробежной силы, если угловая скорость равна 100 рад/сек, а расстояние до центра ротора 40 см (силой тяжести пренебречь)? Плотность меди 8,93 г/см³, вязкость глицерина 4000 мПа∙сек (30^°С).

Решение: Стационарная скорость седиментации шарика:

,

скорость седиментации в процессе центрифугирования:

Пример 6.2. Коэффициент седиментации сферического негидратированного белка А (ρ = 1,120 г/см³) равен 2,5S. Определите коэффициент седиментации сферического негидратированного белка В, имеющего такую же плотность и вдвое меньший радиус. Определите коэффициент седиментации белка В если его степень гидратации δ = 1,1.

Решение: Поскольку коэффициент седиментации для сферических частиц пропорционален квадрату радиуса, коэффициент седиментации белка В будет в 2² = 4 раз меньше коэффициента седиментации белка А. S_в = 2,5/4 = 0,625. Если степень гидратации δ =1,1, то эффективное изменение плотности частицы есть:

Исходная разность плотностей составляла δρ_негидр = 1120 – 1000 = 120(кг/м³), после гидратации δρ_гидр = 1053 – 1000 = 53(кг/м³). Отношение разностей плотностей составляет 0,44. Аналогично вычислим отношение объёмов негидратированного и гидратированного белка В:

.

Кубический корень из отношения объёмов есть отношение радиусов, т.е.

Таким образом, коэффициент седиментации гидратированного белка В выражается через коэффициент седиментации негидратированного белка В следующим образом:

Обратите внимание насколько сильно влияет на коэффициент седиментации высокая степень гидратации, причём основной вклад в снижение коэффициента седиментации вносит снижение плотности эффективной частицы.

ЗАДАЧИ

6.1. Определите силу, действующую на одну молекулу белка, находящуюся в роторе ультрацентрифуги на расстоянии 10 см от центра, если ротор совершает 36000 об/мин, а молекулярная масса белка 10 kDa. Какова удельная сила, действующая на 1 г белка в подобных условиях?

6.2. Коэффициент седиментации сферического негидратированного белка А равен 6,0S. Определите коэффициент седиментации белка А при степени гидратации δ = 0,15; 0,3; 0,6 и 1,2. Определите коэффициент седиментации белка А, молекулы которого не гидратированы, но 25% объёма в центре глобулы заменены растворителем. Плотность негидратированного белка А составляет 1,25 г/см³.

6.3. Проба сферического негидратированного белка А находится в пробирке в роторе ультрацентрифуги на расстоянии 12 см от центра ротора. Получите функцию, связывающую линейную скорость оседания молекул белка с угловой скоростью вращения ротора, если коэффициент седиментации белка А равен 4,0S. Постройте график зависимости v(ω) в пределах 6·10³ - 48·10³ об/мин и оцените время, необходимое для проведения ультрацентрифугирования при разных угловых скоростях.

6.4. Пробирка для ультрацентрифугирования заполнена раствором соли с линейным градиентом плотности от поверхности до дна 1,0 – 3,5 г/см³. В пробирку помещена проба белка с плотностью 1,6 г/см³ (молекулы белка считать сферическими). Получите выражение, связывающее скорость движения молекул белка с их положением в пробирке для двух случаев: а) проба помещена на поверхность раствора; б) проба помещена на дно пробирки. Постройте графики полученных зависимостей. Угловая скорость вращения ротора 42000 об/мин, длина столбика раствора в пробирке 20 см, коэффициент седиментации белка в воде 14S, дно пробирки находится на расстоянии 25 см от центра вращения, вязкость раствора считать постоянной и равной вязкости воды 1,0 мПа∙сек (20^°С).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА

К разделу 1

1. Гроссман С., Тернер Дж. Математика для биологов. М.: Высш. школа, 1983.– 383 с.

2 .Понтрягин Л.С. Обыкновенные дифференциальные уравнения. М.: Наука, 1970. – 332 с.

3. Ризниченко Г.Ю. Лекции по математическим моделям в биологии. Часть 1. – Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», 2002. – 232 с.

4. Рубин А.Б. Биофизика. В 2 т. Изд. 3-е. Учебник. М.: Изд. Моск. ун-та; «Наука». Т. I. Теоретическая биофизика. 2004. – 448 с.

5. Филиппов А.Ф. Сборник задач по дифференциальным уравнениям. М.: Наука, 1985. – 128с.

К разделу 2

1. А.Б. Рубин. Термодинамика биологических процессов. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1984. – 290с.

2. В. Уильямс, Х. Уильямс. Физическая химия для биологов. М.: Мир, 1976. – 600 с.

3. Задачи по физической химии: Учебное пособие/ В.В. Еремин, С.И. Каргов, И.А. Успенская, Н.Е. Кузьменко, В.В. Лунин. М.: Издательство «Экзамен», 2005. – 320 с.

4. П. Нобел. Физиология растительной клетки. М.: Мир, 1973. – 287 с.

5. И. Пригожин, Д. Кондепуди. Современная термодинамика. От тепловых двигателей до диссипативных структур. М.: Мир, 2002. – 461 с.

6. Е.П. Агеев. Неравновесная термодинамика в вопросах и ответах: Учебное издание для студентов, аспирантов и преподавателей химических специальностей. М.: Эдиториал УССР, 2001. – 136 с.

К разделу 3

1. М.В. Волькенштейн. Физика и биология. М.: Наука, 1980. – 152 с.

2. В.И. Веденеев, Л.В. Гурвич, В.Н. Кондратьев, В.А. Медведев, Е.Л. Франкевич. Энергии разрыва химических связей. Потенциалы ионизации и сродство к электрону, (справочник). М.: Изд.АН СССР, 1962. – 214 с.

3. А.Б. Мигдал, В.П. Крайнов. Приближенные методы квантовой механики. М.: Наука, 1966. – 152 с.

4. М.В. Волькенштейн, И.Б. Голованов, В.М. Соболев. Молекулярные орбитали в энзимологии. М.: Наука, 1982. – 240 с.

5. А.С. Давыдов. Квантовая механика. М.: ФМ, 1963. – 748 с.

6. Краткий справочник физико-химических величин. Под ред. А.А. Равделя и А.М. Пономаревой. Л.: Химия, 1983. – 232 с.

7. Рубин А.Б. Биофизика. В 2 т. Изд. 3-е. Учебник. М.: Изд. Моск. ун-та; «Наука». Т. I. Теоретическая биофизика. 2004. – 448 с.

К разделу 4

1. П. Нобел. Физиология растительной клетки. М.: Мир, 1973, – 287 с.

2. B. Hille. Ion Channels of Excitable Membrane. Sunderland, Massachusetts USA. – 814 c.

3. А. Котык, К. Яначек. Мембранный транспорт. М.: Мир, 1980.

К разделу 5

1. Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: Дрофа, 2006. – 285 с.

2. Дж. Лакович. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, 1986.

3. Современые методы биофизичесских исследований. Практикум по биофизикею Под ред. А.Б. Рубина. М.: Высш. шк., 1988. – 359 с.

К разделу 6

1. Л.А. Остерман. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и центрифугирование. М.: Наука, 1981

ОТВЕТЫ К ЗАДАЧАМ