9.4. Микрофлора других объектов

Санитарный контроль за микробным загрязнением предме­тов обихода и других объектов внешней среды проводится в меди­цинских и детских учреждениях, в сети общественного питания, на предприятиях по производству продуктов питания, в эпидемических очагах инфекционных болезней.

В медицинских учреждениях санитарному контролю подлежат инструментарий и оборудование, перевязочный и шовный материа­лы, лекарственные препараты, растворы дезинфектантов и антисеп­тиков, спецодежда, предметы ухода за больными. Главным фактором их контаминации условно-патогенными и патогенными микробами являются выделения больных людей или клинически здоровых мик- робоносителей.

Показателями микробной контаминации считают общее микроб­ное число, численность БГКП, а также протея, энтерококка, синегнойных бактерий, стафилококка и различных видов пато­генных бактерий на поверхностях исследуемых объектов.

Самоочищение водоемов обусловливается рядом факторов. Условно их можно разделить на физические, химические и биологические.

Физические факторы. Самоочищение речной воды происходит в результате разбавления ее чистой водой и свежими притоками. В связи с этим снижается концентрация органических веществ в воде, создаются неблагоприятные условия для размножения микробов. Оседание в воде нерастворимых органических и неорганических частиц, а вместе с ними и бактерий, губительное действие ультрафиолетовых лучей на микроорганизмы способствуют самоочищению водоема.

Химические факторы. Бактериостатическое и бактерицидное действие на микроорганизмы оказывают соли серебра, меди, галогенов (иод, бром и др.), NaCl, растворенные в воде, рН, а также окисление органических и неорганических веществ в водоеме.

Биологические факторы. Огромная роль в самоочищении водоемов принадлежит биологическим факторам, действие которых обусловлено сложными взаимоотношениями гидробионтов. Гидробионты— растительные и животные организмы, приспособленные к жизни в водной среде. К ним относятся микробы, зеленые водоросли, простейшие, бактериофаги и др.

Взаимоотношения водных обитателей могут складываться в виде симбиоза или антагонизма. В конечном результате эти взаимовлияния приводят к самоочищению водоема.

Загрязнение водоемов сточными водами, отходами промышленных предприятий обусловливает усиленное размножение сапрофитных микробов, которые расщепляют сложные органические соединения до простых минеральных (СО2, МН_з) и делают их доступными для питания автотрофных организмов (нитрифицирующих, серои железобактерий, водорослей). Основная роль в удалении из водоемов растворимых веществ принадлежит микробам.

Зеленые водоросли и некоторые бактерии — обитатели рек, озер, морей — вырабатывают антибиотические вещества, губительно действующие на попавших в водоемы микробов, среди которых могут быть возбудители инфекционных болезней человека или животных. Морская вода обладает вирулицидным действием на энтеро-вирусы. Отдельные виды морских бактерий обладают антагонистическими свойствами по отношению к стафилококку, кишечной палочке.

Простейшие поглощают из водоемов коллоиды, взвеси и микробов, в том числе и патогенных. Одна инфузория за 1 ч переваривает до 30000 микробов. Погибшие простейшие и водоросли в свою очередь служат пищей для сапрофитных бактерий.

Бактериофаги вызывают лизис (растворение) гомологичных бактерий (например, дизентерийный фаглизирует дизентерийную бактерию; сибиреязвенный фаг — возбудителя сибирской язвы и т. д.) и способствуют очищению водоемов от патогенных микробов. Бактериофагов обычно обнаруживают в загрязненной речной и морской воде вблизи населенных пунктов.

Механизм антимикробного действия перечисленных гидробионтов неодинаков: от прямого поглощения бактерий до их лизиса или выделения в водоем антибиотических веществ.

В самоочищении водоема участвуют все гидробионты, тем не менее основная роль принадлежит водной микрофлоре, количественный и качественный состав которой меняется в зависимости от содержания в воде органических веществ.

Степень загрязненности водоема называется сапробностью и характеризует особенности водоема: определенная концентрация органических веществ, соответствующая стадия их минерализации, условия развития и состав микроорганизмов. Различают три основные зоны сапробности: полисапробная, мезосапробная, олигосапробная.

Полисапробная зона (зона сильного загрязнения)— вода загрязнена органическими веществами, число микроорганизмов достигает нескольких миллионов в 1 мл, при этом преобладают кишечные и анаэробные гнилостные бактерии, обусловливающие процесс гниения и брожения.

Мезосапробная зона (зона умеренного загрязнения) характеризуется минерализацией органических веществ с преобладанием окислительных процессов и выраженной нитрификацией. Количество бактерий в 1 мл воды составляет сотни тысяч, причем содержание коли-бактерий значительно уменьшается.

Олигосапробная зона (зона чистой воды) обычно не содержит органических веществ. Количество бактерий в 1 мл воды составляет десятки, сотни, преобладают серо-и железобактерии.

Таким образом, наличие определенного количественного и качественного состава микроорганизмов в различных зонах санпробности характеризует активность процесса самоочищения водоема.

12. 1

Определение микробного числа воздуха

Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), аспирации или фильтрации.

Седиментационный метод. Две чашки Петри с питательным агаром оставляют открытыми в течение 60 мин, после чего посевы инкубируют в термостате при 37°С. Результаты оце­нивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих чашках: при наличии менее 250 колоний воздух считается чистым, 250—500 колоний — загрязненным в средней степени, при количестве колоний более 500 — загрязненным.

Аспиралнонный метод. Более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осущест­вляется с помощью приборов. Прибор Кротова (рис. 45) устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром; при этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фик­сируются на всей его поверхности, поскольку чашка (под входной щелью) находится в постоянном вращении После инкубации посева в термостате производят расчет микробного числа по формуле:

а ■ 1000

V

где а —количество выросших на чашке колоний; К—объем пропущенного через прибор воздуха, л; 1000 — искомый объем воздуха, л.

Для определения микробною числа воздуха используют питательный агар, для выделения гемолитических стрептокок­ков—кровяной агар с добавлением генцианового фиолетового, с последующим контрольным микроскопированием и выбороч­ным пересевом подозрительных колоний на кровяной агар. Staph, aureus выявляют методом посевов воздуха на желточно­солевой агар.

12.2

Водопроводную воду засевают в объеме 1 мл, воду откры­тых водоемов —в объемах 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10—12 мл расплавленным и остуженным до 45—50°С питательным агаром, который тщательно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37°С в течение 24-48 ч. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37°С в течение суток, а другую —2 сут при 20°С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глубине среды колоний и вычисляют микробное число воды — количество микробов в 1 мл.

Определение коли-титра н коли-иидекса воды

Коли-титр воды измеряется минимальным количеством воды (в мл), в котором обнаруживаются БГКП, кол и - и н- деке — количеством БГКП, содержащихся в 1 л исследуемой воды. Коли-титр воды определяют бродильным методом и методом мембранных фильтров.

Бродильвый метод. Воду открытых водоемов в объемах 100; 10; 1 и 0,1 мл засевают в глюкозопептонную среду, причем для посевов больших количеств воды (100 и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую десятикрат­ные количества указанных веществ.

Состав г л ю к оз о п е п то и и о Й среды: 1% пелтонная вода, 0,5*/* глю­козы, 0,5% хлорида натрия, индикатор Андреде и поплавок.

Для исследования водопроводной воды делают посев 4 проб по 100 мл и 10 проб по 10 мл или 3 проб по 100 мл и 3 проб по Ю мл в концентрированную среду и 3 проб по 1 мл в обычную глюкозопептонную среду. Посевы инкубируют в течение суток при 37°С. О брожении судят по наличию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб производят посевы на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudo- monadaceae и других оксидазаположительных бактерий, оби­тающих в воде. С этой целью стеклянной палочкой снимают 2—3 изолированные колонии с поверхности среды и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-п- фенилендиамином. При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительном — она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин

Г рамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, вновь исследуют в бродильном тесте —вносят в полужидкий питательный агар с 0,5% глюкозы и инкубируют при 37°С в течение суток. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по таблицам ГОСТа 18963—73 (табл. 11).

Метод мембранных фильтров. Мембранный фильтр № 3 помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуум-насосу (см. рис. 28). Мембран­ные фильтры предварительно стерилизуют кипячением в дистил­лированной воде. Воду из водопроводной сети Москвы и Ленин­града и воду артезианских скважин фильтруют в объеме 500 мл, воду других городов — в объеме 333 мл. Чистую воду открытого водоема фильтруют в объеме 100; 10; 1 и 0,1 мл, более загряз­ненную перед фильтрацией разводят стерильной водой. Затем фильтры помещают на поверхность среды Эндо в чашку Петри и после инкубации при 37°С в течение суток подсчи­тывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2—3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест. Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-п-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. Две — три колонии, не изме­нившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37°С. При наличии газообразования подсчитывают количество крас­ных колоний на фильтре и определяют коли-индекс, из зна­чения которого вычисляют коли-титр. Например, если коли- индекс равен 5, то коли-титр составит 200 (1000 : 5 = 200). Нормативные показатели микробного числа, коли-титра и коли- индекса воды приведены в табл. 12

Для определения титра Staph, faecalis готовят десятикрат­ные разведения воды. Цельную воду и ее разведения в объеме 1 мл засевают в одну из жидких элективных сред (КФ, полимик- синовая и др.), инкубируют при 37°С в течение 2 сут, а затем через 24 и 48 ч производят высевы на чашки с плотными элективно-дифференциальными средами: агар КФ, агар ТТХ (среда с трифенилтетразолхлоридом), полимиксинотеллуритный агар. Идентифицируют фекальные стрептококки по виду коло­ний, морфологии клеток и окраске по Граму. На среде с ТТХ Staph, faecalis образует колонии темно-красного цвета, на агаре с теллуритом — черного цвета.

Состав сред. Среда КФ: 2% питательный агар с 1% дрожжевого экст­ракта, 2% мальтозы, 0,1% лактозы, 0,4% азида натрия, 0,06% карбоната натрия, индикатор бромкрезоловый красный. Полимиксиновая среда: пита­тельный агар, 1% дрожжевого Экстракта, 1% глюкозы, полимиксин М 200 ЕД/мл, индикатор бромтимоловый синий. Полимиксинотеллуритный агар: питательный агар, дрожжевой экстракт, 1% глюкозы, кристаллический фиолетовый 1:800 000, полимиксин М 200 ЕД/мл, 0,01% теллурита калия. Агар ТТХ: питательный агар, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, кристал­лический фиолетовый 1 :800 000, 0,01% ТТХ.

При определении индекса Staph, faecalis пользуются статис­тическими таблицами, применяемыми при установлении коли- индекса. Кроме того, с этой целью используют метод мемб­ранных фильтров.

Для обнаружения патогенных бактерий максимальные объемы воды пропускают через мембранные фильтры, которые затем помещают в жидкие элективные среды или на поверх­ность плотных дифференциально-диагностических сред.

12.3

Определение микробного числа почвы

Почву берут на глубине 10—15 см стерильным ножом (из разных мест исследуемой территории в количестве 10 и большего числа проб) и помещают в стерильную банку. Из проб готовят навеску (30 г), которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Из полученной суспензии готовят разведения 10^-3, 10~⁴,10”®. Из двух последних разведений берут 0,1 мл и смешивают с 40 мл 0,7% расплавлен­ного и остуженного до 45°С питательного агара, после чего выливают в чашки Петри с 2% питательным агаром. Посевы инкубируют при 37°С. Затем подсчитывают количество вырос­ших колоний и определяют микробное число.

Определение коли-титр в, перфрннгенс -титра и титра

термофильных бактерий почвы

Различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера и инкубируют при 43°С в течение 48 ч В дальнейшем анализ проводят по схеме, применяемой при определении коли-титра воды.

Для определения перфрингенс-татра различные разведения почвенной суспензии по 1 мл засевают в пробирки со стерильным обезжиренным молоком или железосульфитной средой Виль­сона—Блера, приготовленный ex tempore. Посевы инкубируют при 43°С в течение 24—48 ч, после чего учитывают результаты по свертыванию молока или по образованию черных колоний Cl. perfringens в агаровом столбике среды Вильсона—Блера. Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопи- руют и вычисляют перфрингенс-титр.

Состав сред. Среда Кесслера; 1% пептонная вода, 5% желчи, 0,25% лактозы, генииановый фиолетовый для подавления роста грамположительных бактерий. Железосульфитная среда Вильсона — Блера; 3% питательный агар, 1% глюкозы, 2% сульфита натрия, 0,08% хлорида железа.

Для определения титра термофильных бактерий разведения почвенной суспензии по 1 мл вносят в чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным питательным агаром. Посевы инкубируют в течение суток при 60°С, а затем подсчитывают количество выросших колоний и делают пересчет на 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическую оценку почвы производят по комплексу показателей, из которых наиболее важным явля­ется установление степени фекального загрязнения (табл. 13).