Морфологические исследования

Репрезентативный для морфологического диагноза почечный биоптат должен содержать минимум 10 клубочков и артерию. Морфологическое исследование почечного биоптата включает три исследования: световую (СМ), иммуногистохимическую (ИГХ) или иммунофлюоресцентную и электронную (ЭМ) микроскопии. Для СМ и ИГХ почечная ткань, фиксированная в 4% забуференном формалине (минимум 2 часа), заключается в гомогенизированный парафин с последующим получением серийных срезов толщиной не более 2-3 μм на ротационном микротоме. Для ЭМ берется содержащий клубочки кусочек биоптата длиной около 1 мм, фиксированный в 2,5% глютаральдегиде. Сочетание всех трех методов исследования в сочетании с данными клинической картины и лабораторно-инструментального обследования позволяет установить максимально точный диагноз.

Световая микроскопия

Серийные срезы располагаются на 16 предметных стеклах, по 3 на каждом, для окраски методами: Гематоксилин-эозин, Шика (PAS), серебрение по Джонсу. Остальные неокрашенные стекла предназначены для дополнительных гисто- (Конго красный на амилоид) и иммуногистохимических исследований. Световая микроскопия играет главную роль в процессе постановки диагноза. Она позволяет оценить состояние клубочков, канальцев, интерстиция и сосудов (Таблица 2).

Иммуногистохимия

Иммуногистохимическое исследование проводится на парафиновых срезах, иммунофлюоресцентное – на замороженных. Определяются следующие показатели: IgG, IgM, IgA, C3, C1 q, C4d (при трансплантированной почке). Дополнительные показатели: каппа и лямбда легкие цепи (для выявления поражения почки при миеломной болезни и др.), SV40 (полиома-вирус в трансплантированной почке) и др.

Электронная микроскопия

Приготовление препаратов для ЭМ включает: заключение в эпоксидные смолы, получение полу- и ультратонких срезов, помещение их на медные сетки с контрастированием.

Схема морфологии нормального клубочка приведена на рис. 2.

Рисунок 2. Схема клубочка в норме (Из учебника Nephrologie. Stuttgart 2007)

Основные морфологические изменения, которые учитываются нефропатологом при постановке диагноза, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Основные морфологические изменения при заболеваниях почек

Световая микроскопия Клубочки (рисунок): - Структуры (эндотелий, мезангий, эпителий, гломерулярная базальная мембрана) - Распространенность: диффузная/ фокальная, тотальная/ сегментарная) - Активные изменения (некроз, апоптоз, гиперклеточность, пролиферация) - Хронические изменения (склероз, гиалиноз) Канальцы и интерстиций Сосуды

Иммуногистохимическая микроскопия - Наличие окрашивания (гранулярное, линейное) на IgA, IgM, IgG, C3, C1q, λ, k, С4d

Электронная микроскопия - Базальные мембраны: утолщение, ламелляция - Мезангиальный матрикс: расширение - Электронно-плотные депозиты: субэндотелиальные, интрамембранозные, субэпителиальные, мезангиальные - Подоциты: расплавление ножек - Другое: тубулоретикулярные структуры, фибриллы и др.

Оценка результатов исследования почечного биоптата

Световая микроскопия играет главную роль в оценке основных структурных элементов – клубочков, сосудов и тубулоинтерстиция. Для взаимопонимания между клиницистами и патологоанатомами важно знание обеими сторонами следующих определений, используемых при описании морфологических изменений (Дж. Михач, Х.Холдер,2010):

Диффузный: патологические изменения, затрагивающие более 50% клубочков.

Фокальный: патологические изменения, затрагивающие менее 50% клубочков.

Глобальный: изменение, поражающее более половины клубочка (клубочковых петель, пространства капсулы Боумена).

Сегментарный: изменение, ограниченное менее чем половиной клубочка (сегментов, долек).

Экссудация: лейкоциты в капиллярных петлях наряду с выходом плазмы или фибрина в полость капсулы.

Гиперцеллюлярность: эндокапиллярная многоклеточность связана со скоплением белых клеток крови в капиллярных петлях и/или пролиферацией мезангиальных клеток; экстракапиллярная многоклеточность связана с пролиферацией клеток париетального эпителия или проникновением лейкоцитов из капиллярных петель в перигломерулярные ткани.

Пролиферация: местное увеличение числа присущих клеток, т.е. мезангиальных, эндотелиальных или эпителиальных (подоцитов или париетальных эпителиальных) клеток.

Клубочковый склероз: увеличение мезангиального матрикса (лучше называть мезангиальным склерозом, поскольку нет волокнистого коллагена).

Клубочковый фиброз: новообразование волокнистого коллагена, главным образом в мезангии.

Гиалин и фибриноид — чисто описательные термины, используемые в световой микроскопии: гиалин = стекловидно гладкий, не ассоциированный с воспалением; фибриноид = окрашивается как фибрин, чаще всего при воспалении.

Гиалин: гиалиновый материал в клубочках, артериолах и канальцевых клетках, состоит из иммуноглобулинов и/или компонентов комплемента.

Фибриноид: составные части плазмы, главным образом иммуноглобулины и компоненты комплемента с или без фибрин(оген)а, выявляется при воспалении и/или некрозе.

Полулуния: пролиферация пристеночных эпителиальных клеток (более 2-х слоев париетальных эпителиальных клеток). Скопление подоцитов, например, при коллабирующем варианте фокально-сегментарного гломерулосклероза, не называются полулуниями.

Синехия/адгезия: слияние капиллярной базальной мембраны с базальной мембраной капсулы Боумена, большей частью благодаря полулуниям при сегментарном склерозе.

Полное описание состояние клубочка – размеров, изменения в капиллярных петлях, мезангии, эндотелии, подоцитах, ГБМ, а также капсулы Боумена, требует использования комплекса световой и электронной микроскопии. Иммуногистологические исследования не заменят электронную микроскопию, и наоборот.

Со стороны канальцев могут определяться различные изменения: некроз, атрофия, расширение. Изменения канальцевого эпителия сопровождают все изменения в клубочках, интерстиции и сосудах. Наиболее важные изменения в интерстиции – отек, фиброз и воспалительная инфильтрация.