Глава4 основные процессы при производстве солода

Извлечение экстрактивных веществ из ячменя при затирании зернопродуктов происходит под действием ферментов, активирующихся и синтезирующихся в процессе солодоращения. Поэтому получение ячменного солода является традиционной и очень важной стадией пивоварения. Во время солодоращения вещества зерна претерпевают глубокие морфологические, физико-химические и биохимические изменения, благодаря которым они становятся доступными для действия целого ряда ферментов.

4.1. ЗАМАЧИВАНИЕ ЯЧМЕНЯ

Решающее значение для прорастания имеет влажность зерна. Вода в зерне выполняет следующие функции:

1. растворителя питательных веществ для зародыша, ферментов, субстратов для действия ферментов и продуктов их гидролиза;

2. среды для действия гидролитических ферментов, жизнедеятельности зародыша;

3. транспортного средства для перемещения питательных веществ эндосперма к зародышу, в эндосперме ферментов, исходных компонентов для образования ферментов.

Воздушно-сухое зерно (влажность 13 – 15%) находится в состоянии вегетационного покоя, содержит лишь связанную с полимерами зерна воду и в таких условиях не способно прорастать. Необходимая для прорастания свободная влага в зерне появляется в результате его замачивания в воде или орошения водой. Условия замачивания существенно влияют на процесс проращивания зерна: его длительность, потери и качество готового солода. При замачивании в процессе насыщения зерна водой к нему необходимо подводить в достаточном количестве кислород, поскольку чем больше зерно поглощает кислорода, тем интенсивнее протекают процессы поглощения воды, обмена веществ и тем большей становится его потребность в кислороде. Важным параметром замачивания ячменя является температура воды. При замачивании в зерне происходят физико-химические и биохимические процессы, в результате которых зерно насыщается водой и интенсифицируется его дыхание.

4.1.1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ПРИ ЗАМАЧИВАНИИ

При замачивании зерна создается разность между концентрацией воды внутри зерна и концентрацией воды, окружающей зерно, вследствие чего вода начинает проникать через оболочку внутрь клеток. Вода диффундирует в зерно по тонким капиллярам – трахеидам зародышевой части, не покрытой мякинной оболочкой. Мякинная оболочка в начале замачивания непроницаема для воды. Плодовая и семенная оболочки являются полупроницаемыми. При этом в зерно вместе с водой проникают и содержащиеся в ней недиссоциированные молекулы многих кислот и щелочей. Оболочки плохо пропускают свободные ионы Н⁺ и ОН, оксиды органических кислот. Проницаемость оболочек зерна для различных солей зависит от концентрации солей в отдельных клетках, рН среды и явлений, свойственных полупроницаемым оболочкам, осмодиффузии, ультрафильтрации. На проницаемости оболочек основано использование стимуляторов и ингибиторов прорастания зерна в процессе замачивания. Таковыми являются пероксид водорода, перманганат калия, хлорид марганца, хлорное железо, цитолитические ферменты, смесь суперфосфата и серной кислоты, экстракты некоторых растений и т. п.

В процессе замачивания мякинная оболочка после частичного растворения пропитывающих ее веществ становится проницаемой для воды. Проникающая в зерно вода адсорбируется высокомолекулярными веществами эндосперма и зародыша. Белковые соединения могут поглощать до 180 % воды, крахмал – до 70 %, целлюлоза – до 30 % в расчете на сухое вещество. Эти вещества в зерне находятся в виде высохших коллоидных студней и поэтому обладают значительной водопоглощающей способностью. Повышение температуры воды приводит к возрастанию степени набухания этих органических коллоидов и увеличению скорости диффузии воды в зерно. Вследствие активного поглощения воды, набухания коллоидов и создания высокого осмотического давления внутри клеток, обусловливаемого растворимыми внутриклеточными веществами, объем зерна при замачивании увеличивается в среднем на 45 %.

Распределяется вода в зерне неравномерно: у основания влажность составляет 47 % в середине – 38, у верхушки – 39, в зародыше – от 68 до 75 %. Благодаря воздушным прослойкам, капиллярным каналам и пустотам, преобладанию в составе зародыша особо гидрофильных белковых веществ его поверхностный слой также имеет более высокую влажность, чем центральный.

Эндосперм зерна ячменя отличается от других структур слабой капиллярностью и межмолекулярной диффузией, поэтому имеет влажность гораздо меньшую, чем зародыш. В начале замачивания зерно поглощает воду быстро, а затем медленно: влажность составляет через 2 ч – 29 %, через 6ч – 32,8, через 12 ч – 35,8, через 18 ч – 37,2, через 24 ч – 38,8, через 48 ч – 42,5 %.

Благодаря высокой влажности зерна некоторые его составные части (сахара, пентозаны, азотистые и минеральные вещества) переходят в растворимое состояние и частично диффундируют в замочную воду. Однако если ячмень перезамочен, то семенная оболочка его структурно разрушается, утрачивает свойство полупроницаемости и из замочной воды к зародышу поступают соли, что приводит к гибели зародыша. Вместе с тем эти соли могут вступать также в реакции с органическими веществами оболочки зерна и влиять на их растворимость. К примеру, ионы кальция воды, взаимодействуя с полифенолами оболочки зерна, образуют плохо растворимые соли, которые благодаря своей коллоидной структуре покрывают пленкой зерно и затрудняют проникновение в него воды.

Результаты замачивания зерна ячменя проявляются в следующем. Замачивание вызывает в первую очередь оживление в нем зародыша, который для своей жизнедеятельности использует сначала растворимые и усвояемые питательные вещества. В щитке зерна активизируются гидролитические ферменты, из щитка они диффундируют в эндосперм, где начинают катализировать гидролиз части высокомолекулярных веществ и превращают их в растворимые соединения. В щитке, а затем в зародыше появляются зерна крахмала. Уже в первые 6 – 12 ч замачивания щиток становится активным к обмену веществ, но он еще не способен производить гидролитические ферменты. Образованию ферментов многократно способствуют стимуляторы роста – гиббереллины, которые попадают из корневой системы в зародыш, а затем к алейроновому слою.

С поглощением воды зародыш начинает потреблять накопленные в нем сахара еще до того, как соответствующие ферменты поступят в эндосперм и путем гидролиза дадут новые порции питательных веществ зародышу через щиток. В последнем адсорбируются резервные вещества эндосперма. Параллельно с увеличением влажности зерна возрастает активность амилаз, рибонуклеазы и фосфатазы, расщепляющихся затем вследствие недостатка кислорода как в зародыше, так и в эндосперме.

Таким образом, вегетационная, поглощенная при замачивании вода в зерне растворяет питательные для зародыша вещества и обеспечивает переход ферментов эндосперма в активное состояние. Питательные вещества из эндосперма диффундируют в зародыш, где расходуются на дыхание и синтез новых высокомолекулярных соединений в тканях корешков и зародышевого листка. В зародыше активизируется обмен веществ, и зерно ячменя начинает прорастать, что сопровождается усилением интенсивности дыхания. Источником энергии, необходимой для поддержания жизни зароды ша и обмена веществ, является окисление Сахаров. Потребление сахара зародышем, как и другим организмом, происходит либо аэробным путем – через дыхание, либо анаэробным – путем брожения. По сравнению с дыханием брожение – процесс, энергетически значительно менее выгодный, поскольку для получения одного и того же количества энергии при брожении расходуется значительно больше сахара, чем при дыхании.

4.1.2. ДЫХАНИЕ ЗЕРНА

В процессе дыхания, как и в процессе брожения, высвобождается энергия, используемая для осуществления разнообразных реакций синтеза, процессов роста, транспорта веществ, и образуются многочисленные метаболиты, служащие исходным материалом для осуществления этих реакций.

Еще в прошлом веке Пфлюгером была высказана мысль о тесной взаимосвязи процессов дыхания и брожения. Особенно яркое выражение эта мысль получила в трудах С. П. Костычева, который вы разил связь между брожением и обычным аэробным дыханием растений общей схемой:

Эта взаимосвязь подтверждается тем, что в растениях найдены все промежуточные продукты, образующиеся при спиртовом брожении, а также все ферменты, катализирующие во время спиртового брожения превращение сахара.

Рисунок 7 – Схема взаимосвязи процессов дыхания и брожения

Начальные этапы аэробного расщепления углеродов состоят в образовании ряда фосфорных эфиров гексоз. Реакции образования фосфорных эфиров гексоз представлены на рис. 7. На первой стадии брожения и дыхания к молекуле глюкозы под действием фермента гексокиназы присоединяется от аденозинтрифосфата остаток фосфорной кислоты. В результате реакции образуются аденозиндифосфат и глюкопиранозо-6-фосфат. Последний под действием фермента глюкозофосфатизомеразы превращается в фруктофуранозо-6-фосфат. Под действием фосфофруктокиназы к фруктофуранозо-6-фосфату присоединяется еще остаток фосфорной кислоты от новой молекулы аденозинтрифосфата, в результате образуется новая молекула аденозиндифосфата и фруктофуранозо-1,6-дифосфат.

Таким образом, образование фруктофуранозо-1,6-дифосфата 'является заключительной реакцией подготовительной стадии аэробного и анаэробного расщепления сахара. Ферментативные ре акции на этой стадии сопровождаются переносом высокоэнергетических фосфатных связей.

Следующий важнейший этап диссимиляции углеводов заключается в разрыве углеродной цепочки фруктозодифосфата и образовании двух молекул триозофосфатов под действием фермента альдолазы. Далее 3-фосфоглццериновый альдегид и фосфодиоксиацетон претерпевают взаимные превращения при участии триозофосфати зомеразы.

Дальнейшему превращению в процессе брожения или дыхания подвергается 3-фосфоглицериновый альдегид. По мере его использования образовавшийся на предыдущей стадии фосфодиоксиаци тон под действием фермента триозофосфатизомеразы превращается в 3-фосфоглицериновый альдегид.

З-Фосфоглицериновый альдегид окисляется в 1,3-дифосфоглицериновую кислоту под действием фермента дегидрогеназы фосфоглицеринового альдегида. Коферментом последнего является NAD или NADH*.

Энергия, освобождающаяся в результате окисления 3-фосфогли-церинового альдегида, аккумулируется в присоединенном остатке фосфорной кислоты, т. е. образуется новая высокомолекулярная связь. 1,3-Дифосфоглицериновая кислота под действием фермента фосфоглицерокиназы отдает один остаток фосфорной кислоты молекуле аденозиндифосфата, в результате образуется аденозинтри-фосфат и 3-фосфоглицериновая кислота, которая под действием фермента фосфоглицеромутазы превращается в 2-фосфоглицери-новую кислоту.

С помощью фермента фосфопируватгидратазы (енолазы) из 2-фосфоглицериновой кислоты получается фосфоенолпировиноградная кислота. При этом от молекулы 2-фосфоглицериновой кислоты отлепляется вода, что приводит к перераспределению внутренней энергии молекулы, в результате чего образуется богатая энергией связь. Фосфоенолпировиноградная кислота передает через фермент пируваткиназу остаток фосфорной кислоты, содержащий высокоэнергетическую связь, молекуле аденозиндифосфата, при этом образуются молекулы аденозинтрифосфата и енолпировиноградной кислоты. Последняя является нестойкой и быстро превращается в более устойчивую кетоформу – пировиноградную кислоту.

Пировиноградная кислота заключительное соединение единой цепочки реакций на первых стадиях дыхания и брожения. Она может далее подвергаться различным превращениям, направление которых зависит от условий среды, и прежде всего от аэробных или анаэробных условий. В анаэробных условиях пировиноградная кислота подвергается превращениям, характерным для спиртового или молочнокислого брожения. В аэробных условиях она частично окисляется до уксусной кислоты или полностью до углекислого газа и воды в соответствии с уравнением аэробного дыхания.

Баланс происходящих при аэробном дыхании химических пре вращений выражен равенством

Приведенное уравнение показывает, что дыхание зерна сопровождается следующими явлениями:

1. уменьшением массы, происходящим вследствие расходования гексоз;

2. изменением состава окружающей зерно атмосферы, происходящим вследствие поглощения из среды кислорода и выделения углекислого газа;

3. выделением в атмосферу вокруг зерна влаги;

4. выделением в среду теплоты.

Полное окисление в процессе дыхания одной грамм-молекулы гексозы должно было бы сопровождаться выделением энергии (стандартным изменением свободной энергии), соответствующим 2870 кДж.

Повышение концентрации углекислого газа и понижение кон­центрации кислорода в межзерновом пространстве вызывает уменьшение интенсивности дыхания зерна и изменение его характера. В клетке или ткани вместо обычного кислородного (аэробного) дыхания начинается процесс анаэробного (интрамолекулярного) дыхания.

Химизм клеточного дыхания представлен последовательной цепью окислительно-восстановительных процессов. По современным представлениям под окислением понимают химические реакции, при которых электроны передаются от одного участника реакции к другому. Соответственно первый участник называется донором электронов, второй – их акцептором. Главными донорами являются элементарный водород, соединения с первичной и вторичной спиртовой и альдегидной группами, карбоновые кислоты с кетонной группой.

В процессе дыхания участвует цепь акцепторов и доноров. Каждое звено этой цепи принимает на себя водород и электроны и пере дает их следующему. При присоединении атома кислорода к субстрату (А) происходит также отнятие электронов (водорода) от субстрата (АО), возникающего в результате его реакции с водой:

Биологическое окисление на примере сульфгидрильных групп показано на рис. 8.

При аэробных процессах, т. е. дыхании, конечным акцептором электронов является не кислород, с энергетической точки зрения не имеющий значения для организма, но позволяющий интенсивно использовать энергию расщепленных химических связей без потерь субстрата, а молекулярный водород.

Рисунок 8 – Общий вид биологического окисления

Если рассмотреть весь путь диссимиляции глюкозы в процессе дыхания – его анаэробную стадию, вплоть до образования пировиноградной кислоты, и дальнейшую аэробную стадию, заключающуюся в полном окислении последней до СО₂ и Н₂О, то можно установить, что окисление любого из соединений, образующихся на пер вой или второй стадии, начинается с дегидрирования — отнятия водорода от данного соединения под действием соответствующей дегидрогеназы (рис. 9).

Водород, отнятый дегидрогеназами от того или иного окисляемого субстрата, передается через ряд промежуточных ферментных систем (/) и соединяется с кислородом воздуха, воспринимающим водород от пиридиновых дегидрогеназ. В этом процессе определяющую роль играют флавиновые ферменты (Я). На следующем этапе окисление водорода осуществляется с помощью ферментов цитохромной системы (///). Эта ферментная система, заканчивающая процесс окисления водорода, получила название «конечной», или «терминальной».

Схематично участников процесса переноса водорода и электронов при дыхании зерна можно представить так:

Рисунок 9 – Диссимиляция глюкозы при дыхании

Субстратами дыхания, подвергающимися окислению путем отнятия водорода с помощью анаэробных дегидрогеназ, служат фосфоглицериновый альдегид, образующийся в анаэробной фазе дыхания, или пировиноградная, изолимонная, α-кетоглутаровая, яблочная и янтарная кислоты, образующиеся в цикле Кребса (рис. 10).

Перенос водорода при дыхании последовательно катализируют три группы оксидоредуктаз: пиридиновые, флавиновые и геминовые. Вначале донором электронов (водорода) являются восстановленные пиридиновые коферменты: NADH; NAD, а затем флавопротеиды, возникающие под действием дегидрогеназ, и янтарная кис лота, которая дегидрогенизируется в цитратном цикле.

Рисунок 10 – Цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса)

Примеры присоединения к NAD двух электронов и их дальнейшего отнятия:

Перенос электронов от флавиновых дегидрогеназ к цитохромной системе происходит при участии негеминовых железопротеи дов типа ферридоксинов и ряда жирорастворимых хинонов, получивших общее название убихинонов (коферментов Q). Они обозначаются Q и имеют в основе следующую структуру:

Эти соединения являются производными 2,3-Диметокси-5-ме-тилбензохинона. Если п = 9, то мы имеем кофермент Q₉, если п = 8, то кофермент Q₈ и т. д. Они могут легко восстанавливаться, образуя соответствующие гидрохиноны.

При участии флавиновых коферментов и янтарной кислоты водород переносится сначала на кофермент Q (убихинон UQ). В этом процессе участвуют ферменты NAD(F)H₂: убихиноноксидоредуктаза и сукцинат – оксидоредуктаза (дегидрогеназа янтарной кислоты) (акцептор):

Затем восстановленный убихинон UQ дегидрируется (реокисляется) при участии цитохромного комплекса с_и при этом протоны и электроны переносятся на цитохром с:

Эту реакцию катализирует убихинон: цитохром с оксидоредуктаза. На последней стадии восстановления цитохром с снова окисляется кислородом с участием цитохромоксидазы:

На отдельных фазах переноса водорода в дыхательной цепочке постепенно выделяется энергия, которая накапливается в виде макоэргических связей аденозинтрифосфата (АТФ). Образование АТФ, связанное с окислением янтарной кислоты или восстанови тельных пиридиновых ферментов, называется окислительным фосфорилированием.

В отношении NAD или NAD(F)H окислительное фосфорилирование можно выразить суммарной зависимостью:

Таким образом, при аэробном дыхании конечным акцептором водорода является молекулярный водород, в результате образуются вода и углекислый газ, а энергия выделяется в виде теплоты.

Рассмотрим более подробно возможности образования некоторых промежуточных продуктов при дыхании, в частности трикарбоновых кислот.

Пировиноградная кислота под действием фермента пируваткарбоксилазы при участии АТФ конденсируется с углекислым газом и образует при этом нестойкую щавелевоуксусную кислоту, которая быстро превращается в свою енольную форму. В результате окислительного декарбоксилирования второй молекулы пировиноградной кислоты образуются углекислый газ и ацетильный радикал, связанный с коферментом А.

Процесс окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты катализируется сложной системой – многоферментным комплексом пируватдегидрогеназы. Для его осуществления необходимы NAD⁺, липоевая кислота, тиаминпирофосфат, FAD и кофермент А. Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты и других α-кетокислот сопровождается возникновением высокоэнергетических связей.

Образовавшаяся енольная форма щавелевоуксусной кислоты конденсируется под действием цитрат-синтетазы с ацетильным радикалом, образуя в результате лимонную кислоту. Последняя далее превращается в цис-аконитовую кислоту, а затем в изолимонную кислоту, обе реакции превращения лимонной кислоты катализируются одним и тем же ферментом аконитат-гидратазой.

Процесс образования и переноса ацетильного остатка на щавелевоуксусную кислоту под действием цитрат-синтетазы с синтезом в конечном счете лимонной кислоты происходит при участии ко фермента А (СоА). В образовании ацетил-СоА принимает участие аденозинтрифосфат, катализирует его ацетил-СоА-синтетаза. Образовавшийся ацетил-СоА (CH₃CO=S—СоА) содержит высоко энергетическую тиоэфирную связь, при гидролизе которой освобождается 8000 калорий. Адетилкофермент А может затем передавать активированный ацетильный остаток различным соединениям, в данном случае щавелевоуксусной кислоте.

Кофермент А принимает участие не только в переносе ацетильных остатков, но также в переносе ряда других ацетильных групп, например остатков малоновой, бензойной, янтарной кислот и высокомолекулярных жирных кислот. Таким образом, кофермент А важнейший ацилирующий агент организма.

Образовавшаяся рассмотренным выше путем изолимонная кислота декарбоксилируется под влиянием изоцитратдегидрогеназы с образованием α-кетоглутаровой кислоты и СО₂. Далее при окислительном декарбоксилировании α-кетоглутаровой кислоты образуются СО₂ и янтарная кислота, последняя затем окисляется под действием фумаратгидратазы и после присоединения молекулы воды дает яблочную кислоту. Дегидрогенизация яблочной кислоты, происходящая под действием малатдегидрогеназы, приводит к образованию щавелевоуксусной кислоты, способной снова вступить в реакцию конденсации с новой молекулой ацетил-СоА. Следователь но, все реакции окислительной диссимиляции пировиноградной кислоты начнутся снова в соответствии со схемой, показанной на рис. 7.

Такая последовательность и взаимосвязь превращений пировиноградной кислоты получили название цикла трикарбоновых кис лот (цикл Кребса).

Водород, отнятый дегидрогеназами от того или иного соединения на 1, 5, 6, 7 и 9-м этапах цикла трикарбоновых кислот, с помощью цитохромной системы окисляется кислородом воздуха в процессе аэробного дыхания до воды. Кислород воздуха, активируемый цитохромной системой, потребляется исключительно на окисление водорода пировиноградной кислоты и водорода воды, присоединяющейся к соответствующим субстратам на определен ых этапах цикла. Баланс израсходованных и образовавшихся веществ учитывает, что из одной молекулы глюкозы в процессе ее анаэробного расщепления образуются две молекулы пировиноградной кислоты, а также то, что при окислении фосфоглицеринового альдегида в фосфоглицериновую кислоту от каждой окисляемой молекулы отнимаются два атома водорода, которые окисляются в конце концов до воды кислородом воздуха. В итоге получаем обычное суммарное уравнение аэробного дыхания.

Вышеизложенное показывает, насколько важно при замачивании зерна обеспечить ему достаточную подачу кислорода. На практике это осуществляется путем аэрирования, в результате интенсивное дыхание способствует поглощению воды. Если кислорода не хватает, ячмень дышит анаэробно, образуемые метаболиты в большой концентрации ядовиты и снижают естественную жизнеспособность зерна, ведут к разрушению структуры тканей, к их автолизу.

Анаэробное дыхание растений было открыто Л. Пастером и особенно глубоко исследовано академиком С. П. Костычевым, польским физиологом Э. Годневским и английским ученым Ф. Брекменом. Оно обычно протекает в соответствии с суммарным уравнением спиртового брожения:

Количество энергии, которое выделяется при брожении, составляет всего лишь 234 кДж на одну грамм-молекулу израсходованной глюкозы. Следовательно, для обеспечения себя необходимым количеством энергии организм при брожении должен израсходовать гораздо большее число гексоз, чем при аэробном дыхании

Лекция ПРОРАЩИВАНИЕ ЯЧМЕНЯ

Целью солодоращения является накопление в зерне гидролитических ферментов в свободном состоянии в количествах, необходимых для перевода нерастворимых веществ зерна в растворимые и достижения такого состояния структуры зерна, при котором в благоприятных условиях значительно облегчилось бы действие ферментов на высокомолекулярные соединения зерна. Это состояние зерна называется растворением и характеризуется разрыхлением эндосперма.

В природе процессы, близкие к искусственному солодоращению, происходят с любым зерном в начале образования из негорастения|: когда начинают развиваться зачаточные органы зародыша – зародышевый листок и зародышевые корешки.

Замачивание обеспечивает подвод к зерну необходимого количества влаги для зарождения в нем обмена веществ. В зародыше и ближайшей к нему области зерна находится сравнительно небольшой запас веществ, необходимых для обменных процессов. Это сахара, аминокислоты, полипептиды, различные минеральные вещества, которые растворяются в поступившей в зерно воде и путем диффузии через щиток проникают к зародышу, обеспечивая на первое время его питание. Но для развития дальнейших процессов питания и роста зерна требуется постоянный подвод к зародышу новых количеств низкомолекулярных соединений. Поступившая вода усиливает гидратацию веществ зерна, создавая тем самым благоприятные условия для процессов гидролиза высокомолекулярных соединений: полисахаридов, белков и др. А гидролиз этих соединений осуществляют уже непосредственно ферменты, которые также благодаря наличию воды образуются и начинают проявлять свою активность.

МЕХАНИЗМ АКТИВАЦИИ И СИНТЕЗА ФЕРМЕНТОВ

В созревших зернах большая часть содержащихся ферментов адсорбирована протоплазменными структурами клеток и находится поэтому в неактивном состоянии, например β-амилаза. В процессе солодоращения в насыщенном водой зерне наряду с активацией уже имеющихся ферментов происходит и их новообразование, т. е. синтез. При проращивании образуются α-амилаза, протеазы, геми целлюлазы, предельная декстриназа и др. Условия стадии благо приятны для того, чтобы все группы ферментов ячменя с первого этапа их образования или активации начинали взаимодействовать с соответствующими субстратами эндосперма зерна.

Накапливающиеся протеазы постепенно растворяют белковую оболочку крахмалсодержащих клеток, которая состоит преимущественно из белка глютелина. Освобождаются гемицеллюлозные составляющие стенок клеток для воздействия цитолитических ферментов, открывается доступ для действия амилолитических ферментов на крахмальные зерна. Амилолизу крахмала эндосперма способствует также действие протеолитических ферментов, расщепляющих белковую матрицу, в которую «уложены» зерна крахмала.

Ферменты синтезируются при непосредственном участии нуклеиновых кислот, в которых закодирована генетическая информация об их структуре. Синтез происходит в субклеточных структурах – рибосомах, содержащихся в цитоплазме, митохондриях и хлоропластах. Аминокислоты для синтеза ферментов появляются двумя путями: за счет образования неорганических азотистых соединений нитратов и аммиака и за счет продуктов протеолитического распада белков при проращивании.

Целый ряд ферментов, таких, как некоторые протеазы, β-амилаза. есть в ячмене, и при проращивании они резко увеличивают свою активность. Рассмотрим механизм активации ферментов на примере β-амилазы. В исходном ячмене β-амилаза находится в эндосперме, где прочно связана с белковыми веществами дисульфидными мостиками, поэтому практически неактивна. При проращивании создаются благоприятные условия для проявления активности протеолитических ферментов ячменя. Протеазы достаточно активно гидролизуют белки, связывающие β-амилазу, и освобождают ее.

В процессе солодоращения участвуют четыре группы гидролитических ферментов:

1. протеолитические ферменты, расщепляющие высокомолеку лярные азотистые вещества (протеазы);

2. цитолитические ферменты, гидролизующие некрахмалистые полисахариды (цитазы);

3. амилолитические ферменты, расщепляющие крахмал (амилазы);

4. липолитические ферменты, расщепляющие жиры (липазы).

ПРОТЕАЗЫ ЯЧМЕНЯ И СОЛОДА

Значимость протеаз достаточно велика по многим факторам. Продукты гидролиза белков ячменя, образующиеся при проращивании зерна и его затирании, во многом определяют вкус, цвет, пенистость готового пива и его стабильность при хранении. С активностью протеолитических ферментов ячменя и солода связаны так же интенсивность протекания многих биохимических процессов и проявление ряда физиологических свойств зерна как при получении солода, так и при получении пива.

Основное количество протеолитических ферментов (80 – 90 %) с высокой удельной активностью сосредоточено в эндосперме зерна. Хотя в оболочках ячменя содержится небольшое количество протеаз, их удельная активность значительно выше, чем в зародыше. Значение протеаз ячменя и солода заключается не только в гидролизе белков зерна при проращивании, но и в регуляции синтетических процессов, имеющих место в зародыше и оболочках зерна.

Протеазы ячменя и солода отличаются растворимостью. Часть протеаз извлекается водой, часть – солевым раствором, часть остается в нерастворимом состоянии. В водную среду переходит около 60 % общего количества протеолитическиххферментов, содержащихся в зерне. Количественный и качественный состав их в полной мере не изуче6н. Неясна до конца роль некоторых из обнаруженных к данному времени протеаз, поскольку не найдены конкретные точки приложения их активности.

По механизму гидролиза пептидной связи протеазы классифицируют на протеиназы (эндопептидазы), гидролизующие пептидные связи внутри молекулы белка, вдали от ионизируемых функциональных групп, и пептидазы (экзопептидазы), гидролизующие пептидные связи на концах молекул белка. Действие этих протеаз зависит от типа функциональной группы, расположенной вблизи гидролизуемой пептидной: аминопептидазы, дипептидазы, карбоксипептидазы.

В альбуминной фракции ячменя и солода обнаружены три типа протеиназ, различающихся по оптимуму действия рН: кислые, нейтральные и щелочные. Максимальная активность кислых протеиназ наблюдается при рН 3,8, нейтральных – 6,0, щелочных – 8,61 В ячмене и солоде преобладают кислые протеиназы, активность которых в 4,4 раза выше, чем нейтральных. Оптимальная температура для действия протеиназ 45 – 55 °С. При 70 °С уже за 2 мин полностью инактивируются все протеиназы.

Для ячменя и солода кислые протеиназы имеют наибольшую практическую ценность, они активируются при проращивании ячменя в максимальной степени. За трое суток проращивания активность кислых протеиназ увеличивается в 15,5 раза, наиболее интенсивно – на третьи сутки. В эндосперме максимум их активности наблюдается на вторые сутки проращивания, затем она продолжает медленно расти. В зародыше удельная максимальная активность этих ферментов наблюдается в первые сутки проращивания, к третьим суткам она снижается в 2 раза. Температурный оптимум для кислых протеиназ выше, чем для нейтральных. Это свидетельствует об их высокой термостабильности, которая быстро снижается по мере прорастания зерна.

При солодоращении активность всех пептидаз в наибольшей степени возрастает в первые трое суток. При сушке солода и в процессе затирания их активность значительно снижается. Значение активности пептидаз в солоде находится на таком же низком уровне, как и в начале прорастания ячменя. Поэтому пептидазы не играют значительной роли в процессе глубокого превращения азотистых веществ ячменя и солода ни при солодоращении, ни при затирании. Это обстоятельство вызывает необходимость в подборе ячменя с минимальным содержанием белка.

В результате проращивания в ячмене снижается содержание не растворимых белков и белков, растворимых в щелочи и спирте, увеличивается количество водорастворимых белков и продуктов их ферментативного гидролиза — пептонов, полипептидов, аминокислот.

Количество азотистых веществ, претерпевающих превращения при солодоращении, может достичь 50 %, но поскольку это результат гидролитических процессов и синтеза, на что тратится около половины продуктов белкового распада, то в готовом солоде величина распада белков характеризуется содержанием 35 – 41 % растворимых белков (показатель Кольбаха), Он показывает количество растворимого азота (%) в сусле от общего содержания белка в солоде. Это очень важный технологический показатель в пивоварении, позволяющий судить о глубине превращений, происходящих при солодоращении, о степени растворения солода. В зависимости от значения показателя Кольбаха растворение солода бывает очень хорошее > 41; среднее 35 – 41; недостаточное < 35.

Условия для воздействия протеолитических ферментов солода в дальнейшем технологическом процессе, создаются при затирании зернопродуктов, особенно при ведении его по двухотварочному методу. Это связано с более благоприятной для протеаз начальной температурой затора. Таким образом, становится понятно, что скорость распада белков и накопление низкомолекулярных продуктов протеолиза при приготовлении пивного сусла определяются прежде всего протеиназами, а они создают предпосылки для действия пептидаз солода.

ЦИТАЗЫ ЯЧМЕНЯ И СОЛОДА

В процессе разрыхления зерна ячменя при солодоращении, т. е. перехода твердого состояния мучнистого тела эндосперма в рыхлое, когда он может быть легко растерт между пальцами, наряду с протеолитическими значительную роль играют цитолитические ферментные системы ячменя и солода. Объектом воздействия этих ферментов являются вещества клеточных стенок эндосперма: целлюлоза, гемицеллюлоза, пентозаны и гумми-вещества, т. е. некрахмали стые полисахариды. Прис выявил две группы протеолитических ферментов, гилролизующих некрахмалистые полисахариды:

1. эндополиглюкозидазы (эндо-β-глюканазы). катализирующие расщепление глюкозидных связей внутри молекулы полисахари дов, т. е. обладающие декстринирующим действием;

2. экзополиглюкозидазы (экзо-β-глюканазы), отщепляющие с ре дуцирующих полисахаридов ди- и трисахариды.

Первая группа ферментов оказывает цитокластическое действие и дает в результате высокомолекулярные продукты распада, вторая обладает цитолитическим действием и ведет при гидролизе к накоплению Сахаров и олигосахаридов. Каждый тип некрахмалистого полисахарида имеет свою группу действующих на него цитаз. Главная составная часть гемицеллюлоз ячменя — β-глюкан. Его гидролизуют:

неспецифическая эндо-β-глюканаза (действует как на β-1,4-, так инар-1,3-связи);

эндо-β-1,4-глюканаза;

эндо-β-1,3-глюканаза;

экзо-β-1,4-глюканаза;

экзо-β-1,3-глюканаза;

целлобиаза (действует на β-1,4-связь в дисахаридах); .

ламинарибиаза (действует на β-1,3-связь в дисахаридах).

Под действием этих ферментов происходит ступенчатый гидролиз β-глюкана до дисахаридов и глюкозы по следующей схеме:

Экзо-β-глюканаза усиливает действие эндо-β-глкжаназы, и гидролиз β-глюкана при участии двух β-глкжаназ идет глубже, чем при действии одной из них. Интересно отметить, что в гидролизатах β-глюкана обычно присутствует только целлобиоза, так как ламинарибиоза быстрее разрушается β-глюкозидазой ячменя и солода. β-Глюкозидазы ячменя и солода могут также осуществлять и реакцию трансглюкозилирования целлобиозы в олиго- и полисахариды.

Во время солодоращения происходит более значительное увеличение активности эндо-β-глюканазы, чем экзо-β-глюканазы. Для процессов проращивания ячменя и затирания зернопродуктов это имеет большое значение, так как важнее уменьшить молекулярную массу некрахмалистых полисахаридов, чем накапливать низкомолекулярные продукты их гидролиза. В результате целостность клеточных стенок нарушается и этим открывается доступ амилазам к крахмальным зернам эндосперма,

Максимальная активность β-глюканаз достигается на 5 – 8-й день проращивания. В зерне ячменя активность эндо-β-1,3-глюканазы невелика по сравнению с активностью эндо-β-1,4-глюканазы. Активация последней при проращивании зависит от содержания в ячмене белка и возрастает в 140 раз. Таким образом, свежепроросший солод по сравнению с ячменем обогащен эндо-β-глюканазой. В процессе солодоращения также резко увеличивается активность целлобиазы — более чем в 100 раз. Добавление гиббереллина при замачивании усиливает биосинтез эндо-β-глюка-назы.

В меньшем количестве, чем гемицеллюлоза и гумми-вещества, в клеточных стенках эндосперма находятся пентозаны: ксилан, арабан, арабиноксилан и т. д. В их превращениях по Прису участвуют четыре фермента.

Арабинозидаза освобождает боковые цепи высокомолекулярного арабиноксилана по связи р-1,2 или р-1,3, в результате образуются олигосахариды.

Эндоксиланаза расщепляет линейные цепи арбиноксилана по β-1,3-, (β-1,4-связям до декстринов, независимо от нахождения разветвлений.

Экзоксиланаза действует на линейные цепи, обязательно с нередуцирующего конца, образует ксилобиозу после удаления от молекул арабиноксиланов ответвлений арабинозы.

Ксилобиаза гидролизует ксилобиозу и ксилотриозу до ксилозы.

Эти ферменты, как и β-глюканазы, действуют ступенчато, гидролизуя пентозаны через гумми-вещества до моносахаридов.

В зерне ячменя активность ферментов, гидролизующих пентозаны, невелика, в процессе солодоращения она увеличивается, но в гораздо меньшей степени, чем активность ферментов, действующих на гемицеллюлозу.

Активность эндоксиланазы увеличивается при солодоращении в 3 раза, экзоксиланазы и ксилобиазы — в 2, арабинозидазы — в 1,8 papa. Максимум образования последнего фермента достигается на четвертый день проращивания.

Между ферментами, разрушающими арабиноксилан и β-глюкан, имеется сходство в механизме их действия, вызванное наличием одинаковых связей в молекулах этих полисахаридов. Но вместе с тем это две разные ферментные системы, так как на разных стадиях солодоращения ячменя они действуют последовательно, а не параллельно. Активность ксилобиазы, как правило, бывает ниже активности целлобиазы, в связи с этим в гидролизатах арабиноксилана ксилобиоза присутствует всегда в большом количестве, а в гидролизатах β-глюкана целлобиоза отсутствует. В ячмене экзопентозаназная система также слабее экзоглюконазной, поэтому при ферментативном гидролизе смешанных полисахаридов ячменя глюкоза в гидролизатах образуется быстрее, чем пентозы.

Таким образом, процесс разрушения клеточных стенок эндосперма ячменя при его проращивании, т. е. цитолиз, осуществляется при участии ферментов. Все эти ферменты могут действовать только в комплексе общих ферментативных реакций, протекающих при солодоращении, и ни один из них в отдельности, каким бы эффективным ни было его действие, не может достичь такого превращения некрахмалистых полисахаридов, которое происходит при проращивании зерна ячменя.

Разрушение целлюлозы и гумми-веществ при солодоращении идет тем быстрее, чем выше активность ферментов, гидролизующих другие некрахмалистые полисахариды. На основании этого Нарцисс предложил принять активность этих цитаз ячменя, и особенно свежепроросшего солода, в качестве показателя пивоваренных качеств ячменя. Оптимальными условиями действия цитаз являются следующие: температура 45 °С, рН 5,0.

Действие цитолитических ферментов на субстраты зерна и процессе проращивания отражается в следующем. Степень расщепления цитазами нерастворимых гемицеллюлоз постепенно снижается, но одновременно растет степень гидролиза растворимых гумми веществ и других продуктов с более низкими молекулярными массами. В прорастающем зерне уменьшается в 4 раза содержание β-глюкана, а количество водорастворимых пентозанов увеличива ется в 3,7 раза. Это происходит за счет разрушения β-глюкана и дес трукции гемицеллюлозы до водорастворимых гумми-веществ, более богатых пентозанами. В результате солодоращения гемицеллолоза эндосперма ячменя гидролизуется на 15 – 23 %. В оболочке зерна количество гемицеллюлозы не изменяется.

Ферментативный гидролиз некрахмалистых полисахаридов ячменя в процессе солодоращения имеет огромное практическое значение. При этом гидролизе стенки клеток эндосперма растворяются и образовавшиеся в солоде амилазы и протеазы при затирании сырья свободно проникают в их содержимое, гидролизуя крахмал и белок. Гидролиз при проращивании водорастворимых некрахмалистых полисахаридов, в частности β-глюкана, приводит к снижению вязкости сусла, что положительно влияет на фильтрование сусла и пива, а также на осветление пива при выдержке.

АМИЛАЗЫ ЯЧМЕНЯ И СОЛОДА

Для максимального извлечения экстрактивных веществ из ячменя и солода важнейшими задачами при проращивании ячменя являются активация и образование амилолитических ферментов.

Амилазы ячменя и солода состоят из двух ферментов: α- и β-амилазы, различающихся механизмом своего действия на крахмал, α-амилаза содержит 13,4 % азота и 0,01 % фосфора, активируется ионами Са²⁺. Вещества, связывающие ионы Са²⁺, инактивируют α-амилазу. Этим солодовая α-амилаза отличается от β-амилазы. Она нестабильна к повышенной кислотности среды и инактивируется подкислением сусла до рН 3,3 при 0 °С, или до рН 4,2 – 4,3 при 20 °С.

Фермент стабилен при рН 5 – 9, а оптимум рН 5 – 6. α-амилаза имеет самый высокий для ферментов солода температурный оптимум 70 °С. Это еще одно существенное отличие α-амилазы от β-амилазы, которая в таких температурных условиях необратимо инактивируется. При 70 °С α-амилаза выдерживает нагревание в течение 20 мин, однако в естественных условиях – при затирании зерно продуктов – она еще более термостабильна за счет присутствия в среде субстрата (крахмала).\

По механизму действия α-амилаза относится к эндоферментам, т. е. оказывает декстринирующее действие на крахмал, гидролизуя α-1,4-глюкозидные связи внутри молекул как амилозы, так и амилопектина (рис. 12, а). При этом происходит разжижение и декстринизаиия крахмала, сопровождающаяся быстрым уменьшенном вязкости среды. Если наблюдать ход этой ферментативной реакции по изменению окраски крахмала и продуктов его гидролиз к с йодом, то получится следующая схема:

α-Амилаза дробит амилозу крахмала на остатки D-гексозы – шестичленные участки цепи, т. е. расщепляет ее в местах перехода спирали витков. Амилопектин ферментом гидролизуется как в основной, так и в боковой цепи. В среднем гидролизат амилозы содержит 13 % глюкозы и 87 % мальтозы, а гидролизат амилопектина 73 % мальтозы, 8 изомальтозы, 19 % глюкозы.

Под действием солодовой α-амилазы на крахмал зернопродуктов одновременно гидролизуются амилоза и амилопектин.

В прорастающем зерне 7 % α-амилазы находится в зародыше, 93 % - в эндосперме. Активность фермента зависит от влажности, содержания кислорода в воздухе.

Как уже было сказано, α-амилаза является типичным компонен том солода и активируется только при прорастании ячменя. α-амилазную активность можно обнаружить в ячмене лишь после длительного хранения его и в очень небольших количествах. Накопление α-амилазы активно происходит до четвертого дня ращения зерна, а затем ее содержание медленно возрастает до своего максимума в конце проращивания.

Рисунок 12 – Механизм действия на крахмал а-амилазы (а) и 0-амилазы (6)

β-Амилаза содержит 14,1 % азота. Активность ее существенно за висит от наличия SH-групп и тирозина, т. е, инактивировать фермент будут вещества, окисляющие сульфгидрильную группу до дисульфидной или вступающие сней во взаимодействие, например, соли тяжелых металлов, меди, серебра, ртути. Причем если первый вид инактивации обратим, то во втором случае фермент реактивировать значительно труднее.

β-Амилаза имеет температурный оптимум в области 60 °С, рН-оптимум 4,5 – 5,0. По механизму действия β-амилаза относится к экзоферментам, т. е. действует на α-1,4-глюкозидные связи с нереруцирующего конца (невосстановленного, неальдегидного), от щепляя мальтозу. Другими словами, β-амилаза обладает осахаривающим действием (рис. 12, б).

Мальтоза образуется в оптической β-форме. При этом синяя окраска амилозы с йодом долго не изменяется. Это объясняется тем, что остатки цепочек сохраняют характер амилозы. Когда они становятся совсем короткими, синяя окраска среды через фиолетовую и красную совершенно исчезает. Гидролиз ферментом основной и боковой цепи в амилопектине идет вплоть до мест разветвления, до α-1,6-глюкозидных связей, перед которыми гидролиз прекращается. Около 60 % амилопектина расщепляется до мальтозы и высокомолекулярных декстринов. Эти декстрины дают с раствором йода красную окраску, не сбраживаются и не обладают восстанавливающей способностью.

Вязкость раствора крахмала уменьшается под действием β-амилазы незначительно в отличие от действия а-амилазы. Как было сказано ранее, β-амилаза содержится в непроросшем ячмене в достаточном количестве и по мере прорастания зерна выходит из неактивного состояния, в результате осахаривающая способность ее резко увеличивается. Если для накопления β-амилазы в достаточны для затирания количествах требуется полный цикл солодоращекия, то β-амилаза в основном накапливается за 4 – 6 сут.

Количественно β-амилаза сосредоточена преимущественно в эндосперме. Максимальную активность при проращивании она проявляет на 2 – 5-й день в зависимости от влажности, сорта ячменя и содержания белка. Уровень активности фермента наиболее высок в алейроновом слое, к середине зерна он уменьшается. Методами электрофореза в ячмене обнаружено семь компонентов β амилазы.

Амилаза, содержащаяся в солоде, является естественной смесью α- и β-амилаз, в ней β-амилаза количественно преобладает над декстринирующей α-амилазой.

При одновременном действии обеих амилаз гидролиз крахмала зернопродуктов происходит намного глубже, чем при действии одного из названных ферментов. В гидролизате содержание мальтозы составляет 75 – 80 %.

В солоде найден еще один фермент, действующий на крахмал, олиго-1,6-глюкозидаза (предельная декстриназа). Предельные декстрины, которые образуются при действии α- и β-амилаз на амило пектин и ими не расщепляются, гидролизуются этим ферментом. Он расщепляет α-1,6-глюкозидные связи и превращает предельные декстрины в мальтозу, мальтотриозу, мальтотетраозу, в результате чего повышается конечная степень сбраживания сусла. Наибольшую активность фермент проявляет на 6-й день проращивания. Сврйства фермента: температурный оптимум 40 °С, инактивируется при 65 °С, рН-оптимум 5,1.

Амилопектин и β-предельный декстрин могут также гидролизоваться под действием специфического амилолитического фермента солода – амилопектин-1,6-глюкозидазы. Свойства фермента: температурный оптимум 40 °С, инактивируется при 70 °С и при рН 3,5; р H оптимум 5,3.

В солоде найдены еще ферменты, гидролизующие продукты расщепления крахмала – гидролазы глюкозидов (сахаридов). Ни одна из этих сахаридаз не была получена в чистом виде, поэтому их свойства не изучены. В ячмене и солоде из сахаридаз обнаружены мальтаза, или α-глюкозидаза, β-глюкозидаза, или целлобиаза, β-фруктофуранозидаза, или сахараза, инвертаза. Эти ферменты имеют второстепенное технологическое значение, так же как трансглюкози дазы. Они относятся к негидролизующим ферментам, однако механизм катализа ими реакций подобен механизму действия гидролаз. В солоде содержатся трансглюкозидазы как фосфорилирую щие (фосфорилазы), так и нефосфорилирующие (циклодекстриназа, амиломальтаза и др.). Эти ферменты катализируют перенос сахарных радикалов.

Условия проращивания (температура, длительность, влажность и т. п.) способствуют максимальному накоплению в солоде амилолитических ферментов и в то же время минимальному расщеплению эндосперма крахмала и минимальному потреблению зароды шем образующихся продуктов гидролиз – глюкозы, сахарозы, мальтозы.

При проращивании на дыхание расходуется до 5 % крахмала из 18 % подвергшегося ферментативному расщеплению (в основном в мелких зернах), оставшаяся часть крахмала эндосперма изменяется лишь структурно, поверхностно. Длина внешних цепочек амилопектина сокращается, в результате чего соотношение связей α-1,4 и β-1,6 сдвигается в сторону последней. Поскольку в больших зернах расщепляется преимущественно амилопектин, то содержание амилозы в крахмале увеличивается в среднем от 25 до 29 %.

В ячменном зерне часть Сахаров уже находится в свободном состоянии. При солодоращении мальтоза образуется за счет незначительного ферментативного гидролиза крахмала и в результате каталитического действия α-глюкозидазы (мальтазы) расщепляется до глюкозы. Глюкоза расходуется зародышем на дыхание с образованием необходимой для жизненных процессов энергии, а также на синтетические процессы, в зародыше начинают образовываться зародышевый листок и корешки. Часть глюкозы превращается во фруктозу, а при конденсации глюкозы и фруктозы образуется сахароза.

Если в ячмене содержится 2 % простых Сахаров, то в свежепро росшем солоде их 8 %. Сюда входят кроме непосредственных продуктов амилолиза – глюкозы, мальтотриозы, мальтодекстринов большое количество сахарозы и производных фруктозы.

Продукты расщепления крахмала диффундируют из эндосперма в зародыш.

Лекция 2

Лекция СУШКА СОЛОДА

Основная цель сушки солода – естественное удаление влаги, а также достижение в солоде специфических вкусовых ароматических качеств, обеспечивающих в готовом пиве соответствующие органолептические показатели.

Свежепроросший солод имеет перед сушкой содержание влаги 43 – 45 %, высушенный должен содержать 1,5 – 4 %. Благодаря такой низкой влажности все жизненные процессы в солоде сводятся до минимума, что свидетельствует о прекращении процесса проращивания ячменя.

Слушку солода в зависимости от происходящих с зерном превращений делят на три основные фазы: физиологическую, ферментативную, химическую.

ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ФАЗА

Во время физиологической фазы сушки в зерне продолжается еще процесс солодоращения, но при более благоприятных температурных условиях. Возможность дальнейшего роста зерна ограничивается влажностью солода 30 % и температурой сушки 45 °С. В таких условиях происходит заметное визуально развитие зародышевого листа и ростков. Зерно продолжает дышать, что сопровождается расходом углеводов, но при этом процесс дыхания несколько отличается от происходящего при проращивании, поскольку углеводы окисляются не полностью. В воздухе над зерном обнаруживаются спирт и альдегиды, последние очень нестойки и вступают в химические реакции с другими летучими и нелетучими веществами, в том числе и в реакции меланоидинообразования. В этот период сушки активность ферментов солода значительно повышается, по скольку влажность и температура приближаются к оптимальным для их действия.

Процесс изменения структуры, т.е. растворение эндосперма, продолжается. Это проявляется в увеличении в солоде количества растворимого азота, низкомолекулярных продуктов распада крахмал и степени расщепления стенок клеток эндосперма. Эти процессы преобладают над ростом листка и корешков.

При температуре более 45 °С физиологические процессы в зерне подавляются. В связи с этим прекращаются синтетические процессы, сопутствующие жизнедеятельности зародыша, а ферментативные процессы продолжаются вплоть до определенного температурного предела.

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ФАЗА

При сушке процессы расщепления высокомолекулярных субстратов эндосперма зерна под действием амилаз, пептидаз, глюканаз и фосфатаз происходят до тех пор, пока этому благоприятствуют температура и влажность. Степень сохранения активности гидролитических ферментов определяется влажностью солода: чем быстрее удаляется влага, тем меньшие изменения претерпевают ферменты. Эти обстоятельства учитывают при различных способах сушки светлого и темного солодов.

На второй фазе сушки температура постепенно повышается до 70 °С, при этом влажность солода снижается до 10%. Различные группы ферментов ведут себя при этом по-разному.

Группа цитолитических ферментов при сушке почти полностью инактивируется, так как уже при 60 °С в течение 15 мин эти ферменты теряют свою активность. Но в процессе сушки они в определенной степени расщепляют гемицеллюлозу, в том числе β-глюкан.

Амилолитические ферменты при сушке понижают свою активность, причем при сушке по режиму для светлых солодов в меньшей степени, чем для темных, β-Амилаза теряет активность в большей степени, чем α-амилаза, которая способна переносить более высокие температуры.

При нормальном режиме сушки солода амилолитическая активность пообщей осахаривающей способности снижается на 32 %, а по декстринирующей – на 16 %. Во время сушки солода уменьшается содержание крахмала с 55,2 – 55,5 до 54,6 – 54,7 %, а также инвертного сахара за счет образования сахарозы, количество которой для светлых солодов увеличивается на 0,3 – 0,5 %. Этот процесс существенно зависит от влажности зерна и при достижении влажности 15 % прекращается. Для максимального сохранения активности амилаз солод с высокой влажностью нельзя подвергать действию высокой температуры. На этой фазе сушки уменьшается количество низкомолекулярных продуктов расщепления крахмала – фруктозы, глюкозы, мальтозы, сахарозы – за счет активного взаимодействия их с азотистыми веществами, значительно возрастающего на последней фазе сушки.

Активность протеолитических ферментов солода зависит от режима сушки. Для светлых солодов при нормальном режиме сушки (95 – 100 °С) активность протеаз сохраняется достаточно хорошо. В начале сушки наблюдается повышение их активности, которая постепенно снижается до исходного уровня. При приготовлении темного солода режим сушки довольно жесткий (112 – 119 °С), так что даже активность протеолитических ферментов значительно снижается.

Общее содержание белковых веществ при сушке уменьшается незначительно, но качественный состав их меняется. Количество коагулируемого азота уменьшается в светлом солоде на 0,10 – 0,27 %, а в темном – на 0,4 %. Вместе с тем количество растворимого азота в солоде увеличивается на 16,1 %, в то время как при солодо ращении – только на 10,2%. Количество формольно титруемого азота, т.е. азота аминокислот, в солоде уменьшается при любых режимах сушки, причем наиболее значительно при сушке темного солода. Количество азотсодержащих соединений в процессе сушки солода уменьшается в результате коагуляции белка при высокой температуре и влажности; расхода низкомолекулярных азотистых веществ на реакции образования красящих и ароматических веществ.

Состав аминокислот в солоде при сушке изменяется не количественно, а качественно. Возрастает содержание глицина, аланина, фенилаланина, валина, лейцина, аргинина, но уменьшается глутаминовой кислоты, пролина, лизина, гистидина.

Активность липаз солода при сушке, также как и протеаз, возрастает. Фосфатаза уже через 4 ч сушки зерна теряет треть своей активности. При этом изменений с субстратами для действия эстераз практически не происходит. Каталаза солода при сушке инактивируергся на 90 %. Активность полифенолоксидазы, пероксидазы в зерне сохраняется после сушки достаточно высокой, соответственно 40 и 70%.

Таким образом, первые две фазы сушки солода характеризуются протеканием преимущественно гидролитических процессов.

ХИМИЧЕСКАЯ ФАЗА

На третьей фазе сушки солода происходят в основном химические процессы, приводящие к образованию в солоде специфических ароматических и вкусовых свойств, приобретению цвета. Накопившиеся в солоде продукты ферментативного распада белков и углеводов под влиянием высокой температуры сушки взаимодействуют с образованием новых соединений – меланоидинов. В этой фазе сушки часть ферментов полностью инактивирована, а та из них, что сохранила свою активность, не в состоянии ее проявлять, поскольку недостаточно влаги и слишком высокая температура среды.

Образование на химической фазе сушки темноокрашенных меланоидинов происходит за счет окислительно-восстановительных реакций между редуцирующими сахарами и аминокислотами, ди- и тридептидами солода. Непременным условием протекания реакции меланоидинообразования является наличие карбоксильных групп в сахарах и свободных аминогрупп в продуктах распада белков. Интенсивность окраски и аромата, а также различие в характере аромата меланоидинов зависят от аминокислоты и углевода, вступающих в реакцию.

По Ходжу, меланоидинообразование включает семь основных видов реакций, которые протекают последовательно или параллельно. Эти виды реакций по развитию окраски мела ноидинов можно разделить на три последовательно идущие стадии

Рисунок 13 – Общая схема меланоидинообразования по Ходжу

Начальная (I) стадия. Продукты на этой стадии бесцветны и не поглощают ультрафиолетового света. Эта стадия включает две реакции:

карбониламинную конденсацию с образованием Шиффова основания, затем N-глюкозида (органического соединения, характеризующегося наличием групп HC=N—). В этой реакции могут участвовать не только свободные аминокислоты, но и некоторые простые пептиды;

изомеризацию при нагревании N-глюкозида путем внутримолекулярной перегруппировки Амадори посредством катиона Шиффова основания с образованием N-замещенной 1-амино-1 дезокси-2-кетозы в двух формах. Эти вещества благодаря наличию группы −С=О− являются очень реакционноспособными и служат исходными продуктами для образования темноокрашенных меланоидинов.

Рисунок 14 – Характеристика реакций меланоидинообразоваиия по Ходжу

Промежуточная (II) стадия. Продукты на второй стадии мелано идинообразования бесцветные или слабо-желтые, но обладают способностью к поглощению длинных волн УФ-части спектра. На этой стадии происходит дегидратация 1-амино-1-дезокси-2-кетозы, которая в зависимости от условий среды (влажности и температуры) может идти различными путями.

При дальнейшем нагревании солода это соединение может превращаться в фурфурол, если исходным сахаром была пентоза, или в оксиметилфурфурол в случае участия в реакции гексозы. Продуктами распада 1-амино-1-дезокси-2-кетозы по другому пути в более мягких условиях станут другие альдегиды: пировиноградный, метилглиоксаль, ацетоин, диацетил. Некоторые из них обладают приятным вкусом и ароматом.

В нейтральной среде при невысоких температурах сушки солода основными промежуточными продуктами будут не фурфурол или оксиметилфурфурол, а шестиуглеродные редуктоны с незамкнутой цепью. Они образуются при дегидратации продукта перегруппировки Амадори с потерей двух молекул воды и разрывом кольца. Общим свойством редуктонов является ярко выраженная редуцирующая способность благодаря наличию эндиольной группы. Эта группа связана с альдегидным или кислотным радикалом. Наличие эндиольной и карбоксильной групп обусловливает способность редуктонов к окислительно-восстановительным реакциям. Редуктоны в дегидроформе участвуют в создании коричневого цвета продуктов.

Одновременно с образованием всех этих соединений во второй стадии меланоидинообразования происходят реакции взаимодействия фурфурола и оксиметилфурфурола с аминокислотами, реакции переаминирования редуктонов с аминокислотами и т. д. Образовавшиеся альдегиды играют основную роль в создании вкусовых и ароматических свойств.

Конечная (III) стадия. На этой стадии образуются продукты с интенсивной окраской. Они активно поглощают ультрафиолетовый свет, не восстанавливают фелингову жидкость, но обладают восстановительной способностью по йоду. В последней стадии происходят в основном два процесса:

1. альдольная конденсация, когда из двух молекул альдегида получается новый альдегид, например альдоль – безазотистое вещество коричневого цвета;

2. альдегидаминная полимеризация промежуточных продуктов, образуемых в первой и второй стадиях.

В результате полимеризации образуются также другие сложные ненасыщенные гетероциклические азотистые соединения, например пиррол, имидазол, пиримидин, пиразин. Эти продукты имеют коричневую окраску различной интенсивности.

Альдольная конденсация протекает только при карамелизации чистых растворов Сахаров. При наличии хотя бы следов аминосоединений протекают одновременно полимеризация и конденсация.

Рисунок 15 – Схема меланоидинообразования по В.Л. Клетовичу

Конечная степень меланоидиноообразования приводит сначала к образованию растворимых, а затем нерастворимых в воде, интенсивно окрашенных полимеров – меланоидинов. В. Л. Кретович предложил в общем виде схему меланоидинообразования (рис. 15).

По способности к меланоидинообразованию пентозы (ксилоза, арабиноза) более активны, чем гексозы (манноза, галактоза, фруктоза, глюкоза). Дисахарид мальтоза менее реакционноспособен в этой реакции, чем моносахариды. В свою очередь, сахара по способности к меланоидинообразованию уступают альдегидам. Оксиметилфурфурол дает реакцию потемнения прежде всего с пролином, фенилаланином, глутаминовой и аспарагиновой кислотами.

Аминокислоты также характеризуются различной способностью участвовать в этой реакции, и их в соответствии с этим можно расположить в следующий ряд: гликокол > аланин> фенилаланин > валин > лейцин > метионин > аспарагиновая кислота > глутаминовая кислота > цистеин > тирозин.

Анализируя этот ряд, нетрудно заметить, что с увеличением молекулярной массы аминокислоты образование комплексных соединений с сахарами затрудняется. Чем дальше друг от друга удалены карбоксильная и аминная группы, тем более химически активны аминокислоты в реакциях меланоидинообразования.

Наряду с аминокислотами в реакции меланоидинообразования могут участвовать амины, соли аммония, полипептиды, белки. Кроме Сахаров в этой реакции участвуют органические кислоты, полифенолы, другие соединения, имеющие карбоксильные группы или группы, способные их образовывать.

Для полифенолов меланоидинообразование происходит так. Вначале полифенолы под действием кислорода образуют хиноны, содержащие карбонильную группу, которые конденсируются с аминокислотой с образованием соединений типа Шиффова основания и далее по реакции:

Аромат меланоидинов во многом зависит от аминокислоты, участвующей в реакции. Например, гликокол дает продукты с яркой окраской, но со слабым ароматом пива, с лейцином получается хлебный аромат, аспарагиновая и глутаминовая кислоты дают apомат миндаля. Характерный аромат темных сортов пива обуславливает меланоидины.

Коричневые оттенки придают солоду также и свободные от азота соединения, например терморасщепление углеводов ведет к образованию карамельных веществ, а окисление полифенолов – к образованию меланинов. Карамели – это полимеры сахаров, образованные при их одновременной дегидратации. Меланины – это фенольные полимеры на основе пирокатехина, тирозина, пнрокатеховой и салициловой кислот.

При окислении полифенолов получаются также днкарбонилы способные реагировать с аминокислотами, а затем полимеризоваться и образовывать меланоидины. О протекании такой реакции свидетельствует уменьшение при сушке содержания в солоде антоцианогенов, происходящее, очевидно, в результате действия оксидаз, которые на стадии подсушивания солода могут отличаться высокой активностью

В составе меланоидинов 54 – 60% углерода, 4,9 – 5,2 водорода, 3,5 – 5,3 азота, 31,3 – 35,1 % кислорода. Характерные для них функциональные группы – спиртовые, карбоксильные, карбонильные, фенольные. Растворы меланоидинов обладают кислой реакцией и ярко выраженными восстановительными свойствами. Поэтому благодаря их присутствию в сусле создается определенный окислительно-восстановительный потенциал.

Меланоидины являются частично растворимыми, несбраживаемыми веществами, лиофильными коллоидами. Они защищают не стойкие коллоиды, находящиеся в пиве, предотвращая их выпадение в осадок и образование мути, выполняют также функцию антиоксидантов и предохраняют нестабильные белковые вещества пива от окисления. Благодаря своим коллоидным свойствам меланоидины в растворе дают прочные поверхностные пленки и поэтому являются хорошими пенообразующими продуктами, повышая стойкость пива.

3. ИНТЕНСИФИКАЦИЯ СОЛОДОРАЩЕНИЯ

Из-за расхода сухих веществ на развитие ростков, корешков и дыхание зародыша производство солода связано с их значительной потерей. Эти процессы взаимозависимы, и подавление дыхания неизбежно вызывает торможение роста. Поэтому способы интенсификации производства солода связаны прежде всего, с факторами, влияющими на эти процессы.

Зерновые оболочки злаковых растений содержат важные в биологическом отношении соединения фенольной природы. Они являются регуляторами роста растений и определяют степень биосинтеза эндогенных растительных гормонов, а также активность ферментов, принимающих участие в диссимиляции. При замачивании ячменя фенольные вещества из оболочек частично диффундируют в замочную воду, активируя и ингибируя (в зависимости от концентрации) действие различных ферментов. Кроме того, из зародыша и алейронового слоя ячменя в процессе замачивания в замочную воду переходят витамины: тиамин, рибофлавин, биотин. Содержание этих витаминов в воде после замачивания зерна достигает соответственно 0,05; 0,26; 0,07 мг %. Диффузия биологически активных веществ из ячменного зерна в воду практически заканчивается после 24 ч замачивания. Эти вещества можно использовать в качестве регуляторов роста зерна. Создавая определенную концентрацию регуляторов роста в замочной воде, можно частично подавить дыхательную способность зерна и, следовательно, ослабить синтетические процессы в зародыше, не влияя на ферментативный гидролиз, биополимеров в эндосперме.

Применяя принцип перезамачивания, ячменя, можно уменьшить потери на дыхание за счет ингибирования фенолами активности окислительно-восстановительных ферментов в зародыше.

Контрольные вопросы и задания. 1. Что такое замачивание ячменя? Каково его технологическое назначение? 2. В чем состоят функции воды в зерне? 3. Какие процессы происходят при замачивании: физические; физико-химические; биохимические? 4. Каким законам подчиняется проникновение воды внутрь зерна? 5. Какова гидрофильность отдельных составляющих зерна ячменя? Расположите их по степени набухания. 6. Почему возможен двусторонний диффузионный ток от эндосперма к эмбриональным клеткам и обратно? Какое значение для технологии солодоращения это имеет? 7. Назовите биохимические реакции, протекающие с выделением энергии. Куда используется эта энергия? 8. Охарактеризуйте процесс аэробного и анаэробного дыхания. 9. Какие вещества в процессе дыхания называют акцепторами, какие донорами? 10. Дайте схематическое изображение дыхательной цепи. Какие основные ферментные системы катализируют процесс дыхания? 11. Какие вещества являются поставщиком фосфорной кислоты для дыхания? 12. В чем выражаются морфологические изменения в зерне при проращивании? 13. Перечислите биохимические изменения, происходящие в зерне при проращивании. 14. Откуда в зерне появляются аминокислоты, необходимые для синтеза ферментов? 15. Какие ферменты находятся в зерне ячменя? Почему они не проявляют свою активность до замачивания и проращивания зерна? Какие ферменты синтезируются в зерне при проращивании? 16. Каким ферментам обязано существенное изменение состояния эндосперма в результате проращивания? Какие вещества зерна являются субстратами для действия этих ферментов и где они находятся в зерне? 17. Поясните механизм действия гидролаз и тип гидролизуемой связи в субстратах. В каком месте зерна сосредоточены эти ферменты? 18. Сравните условия действия протеаз с условиями солодоращения и пивоварения. Укажите реальные возможности для проявления активности всех групп протеолитических ферментов солода. 19. Проведите сравнительный анализ распада отдельных соединений зерна при проращивании в количественном отношении. Как влияет степень распада на структуру зерна? 20 Как изменяется крахмал солода по сравнению с крахмалом ячменя: по температуре клейстеризации; по соотношению амилазы и амилопектина; по строению этих составляющих крахмала; по плотности. 21. Как изменяются некрахмалистые полисахариды в солоде по сравнению с таковыми в ячмене по содержанию; по вязкости; по фракционному составу? 22. Как изменяются азотистые соединения солода по сравнению с ячменем: по содержанию; по фракционному составу; по растворимости; по другим свойствам? 23. Проанализируйте изменение фракционного состава белков при проращивании. Что можно сказать о характере влияния этих изменений и последующие технологические операции? 24. Какой показатель качества солода отражает деятельность фосфотаз при проращивании? Приведите его величины до и после получения солода. 25. Претерпевают ли изменения полифенольные соединения при солодоращении? В каких свойствах полифенолов это отражается? 26. Назовите процессы, происходящие при сушке свежепроросшего солода, и фазы сушки. 27. Почему правая фаза сушки называется физиологической? Назовите признаки этого. Назовите параметры фазы. 28. Как изменяется активность ферментов солода во время его сушки? 29. Как изменяется количественный и качественный состав во время сушки: углеводов; азотистых соединений? В результате каких химических и биохимических процессов произошли эти изменения? 30. Что такое меланоидины? Каковы их свойства? Назовите стадии меланоидинообразования по Ходжу и охарактеризуйте роль образующихся продуктов для качества солода, пива. 31. Какие соединения будут определять вкус и аромат готового солода? 32. Зависит ли эффективность меланоидинообразования от типа аминокислоты, вступающей в реакцию?

Лекция 3