Изоэлектрические точки некоторых белков

Белок	рНI
Пепсин Уреаза Каталаза Рибонуклеаза Лизоцим	1,0 5,1 5,6 7,8 11,0

3.8. Определение аминокислотной последовательности полипептидных цепей

Точка отсчета – 1953 г. – Фредерик Сэнгер (F. Sanger) впервые определил последовательность аминокислот в белковом гормоне – инсулине. Определение аминокислотной последовательности белка – процесс многостадийный:

1. Определение аминокислотного состава белка. Проводят полный гидролиз всех пептидных связей чистого протеина, затем анализируют качественный и количественный состав входящих в него аминокислот.

2. Идентификация N- и С-концевых остатков полипептида. Метка N-концевого остатка цепи: 1-фтор-2,4-динитробензол:

При кислотном гидролизе все пептидные связи расщепляются, кроме ковалентной связи «метки» с первым аминокислотным остатком. Анализируется первый аминокислотный остаток.

Другая «метка» N-концевого аминокислотного остатка: дансилхлорид.

С-концевой остаток также можно идентифицировать, например, карбоксипептидазой. Среди других химических методов довольно широко применяется гидразинолиз (предложен японским химиком С. Акабори).

Схема гидразинолиза:

ограничения этого метода: разрушаются глн, асн, цис, арг  орн; гидразиды сер, тре и гли легко переходят в свободные аминокислоты (трудно интерпретировать результаты).

3. Расщепление полипептидной цепи на фрагменты. Существует несколько методов. Один из широко распространенных – при помощи трипсина (высокоспецифичного фермента) цепь «расстригается» в местах тех пептидных связей, в образовании которых участвовали карбоксильные группы аргинина и лизина.

4. Определение последовательности аминокислот в пептидных фрагментах. Расщепление по Эдману (деградация по Эдману, реакция Эдмана) – остроумный метод, предложенный П. Эдманом (P. Edman).

Эдман предложил использовать фенилизотиоцианат (ФИТЦ) для реакции с концевой аминогруппой, т.к. в ходе слабокислого гидролиза отщепляется только! первый аминокислотный остаток, связанный с ФИТЦ. Шаг за шагом можно отделить все аминокислотные остатки и идентифицировать их.

3.9. Номенклатура и классификация белков

До сих пор нет ни строгой номенклатуры, ни научной классификации белков. Используют тривиальные названия: авидин – белок яйца (от лат. avis – птица), казеин – белок молока (от лат. caseus – сыр) и др.

БЕЛКИ

• по форме молекул

фибриллярные (волокнистые)

глобулярные (корпускулярные)

• по степени сложности

I простые (протеины) альбумины; глобулины; проламины; глютелины; гистоны; протамины; протеиноиды.

II сложные (иногда – протеиды) липопротеины; фосфопротеины; металлопротеины; гликопротеины.

Простые белки

1. Альбумины – водорастворимые белки. Осаждаются при насыщении растворов нейтральными солями (65-100 %) [(NH₄)₂SO₄, NaCl+MgSO₄, Na₂SO₄+MgCl₂ и др. смесями одно- и двухвалентных катионов]. Альбумины составляют 50 % всех белков плазмы крови человека, содержатся в белке яиц (до 50 %), молоке, растениях.

2. Глобулины – белки, нерастворимые в воде, растворимы в слабых растворах нейтральных солей, например, в 50 % (NH₄)₂SO₄. В концентрированных растворах осаждаются. Глобулины составляют большую часть белков семян растений, особенно бобовых и масличных (легулин – в горохе, фазеолин – в фасоли, эдестин – в конопле и др.).

3. Проламины – в их составе много про и глу (в незначительных количествах: лиз, арг и гли). Хорошо растворяются в 60-80 %-ном этаноле. Характерны исключительно для семян злаков, играют роль запасных белков (глиадин – в семенах пшеницы и ржи, гордеин – в семенах ячменя, зеин – в семенах кукурузы).

4. Глютелины – белки, растворимые в щелочных растворах (0,2-2 % NaOH) (глютенин – в пшенице, оризенин – в рисе, в основном, в семенах злаков и бобовых растений).

5. Гистоны – щелочные белки, Mr=12-30 тыс. а.е.м. Растворимы в слабых кислотах (0,2 М HCl). Содержа не менее 30 % основных аминокислот: арг, лиз, гис, не содержат три, цис. Осаждаются аммиаком и спиртом. Присутствуют в ядрах клеток животных и растений, преобладают в белках хромосом. В клетках прокариот не обнаружены.

6. Протамины – сильно основные белки с низкой молекулярной массой (до 12 тыс.). Содержат не менее 80 % основных аминокислот (особенно много арг). В них нет цис, три, асп, часто нет три, фен. Растворяются в слабых кислотах, не осаждаются при кипячении. Содержатся в половых клетках человека, животных и растений.

7. Протеиноиды – трудно растворимые белки с высоким содержанием S (цис, мет). К ним относятся фибриллярные белки: фиброин – белок шелка, кератины – белки волос, рогов, копыт, коллагены – белки соединительной ткани и др.