410 Глава 14

положения соответствующей группы в молекуле, так что все по­лосы перекрываются и вследствие этого в спектре содержится несколько относительно широких полос (рис. 14-22).

Применение инфракрасной спектроскопии

Приведем краткое описание относительно распространенных об­ластей применения ИК-спектроскопии.

Определение относительного содержания а-спирали, р-струк­туры и беспорядочного клубка в белках по интенсивностям раз­личных амидных полос, например полосы амид I. Возможность этого обусловлена тем, что 1Д_Мако полосы амид I отличаются для а-спирали, p-структуры и беспорядочного клубка. Они со­ставляют 1650 и 1658 см^-1 для а-спирали и беспорядочного клуб­ка, соответственно и 1632 и 1685 см^-1 для p-структуры. Наиболь­шую чувствительность имеет ИК-спектр по отношению к р-форме.

Идентификация обменивающегося атома водорода. Частоты многих полос изменяются при замещении дейтерия на водород. Обычно известно, какой функциональной группе (карбонильной, окси-, аминогруппе) соответствует данная полоса; наблюдая за тем, какие полосы изменили свое местоположение в спектре, можно идентифицировать группы, в которых возможен обмен. Так как обычно атомы водорода некоторых функциональных групп (например, оксигруппы) обмениваются быстро, то замед­ленное изменение v_MaKc в этих группах указывает на замедление обмена; это, как правило, означает, что группа труднодоступна.

Идентификация числа водородных связей и функциональных групп, участвующих в образовании водородных связей, и изуче­ние разрыва водородных связей при денатурации. Это может быть сделано, например, путем растворения макромолекулы в D₂0, денатурации образца и наблюдения за тем, какие полосы, соответствующие дейтерированным группам, появляются в про­цессе денатурации.

Идентификация таутомерных форм по появлению новых по­лос. Предположим, что некоторая молекула содержит окси- группу, но ее ИК-спектр указывает на присутствие карбониль­ной группы. Это является серьезным доказательством наличия таутомерии. Если эта молекула входит в состав макромолекулы, относительные интенсивности полос, соответствующих окси- и карбонильной группам, могут изменяться по сравнению со сво­бодной молекулой — одна из полос может даже исчезнуть. Та­кого рода данные обычно указывают на химическую структуру мономерного звена в полимере. Это было особенно важно для понимания структуры нуклеотидов и влияния различных нуклео­тидов на частоту мутаций.

Использование поляризованного ИК-света для определения ориентации водородных связей в вытянутых пленках белков и полипептидов путем установления ориентации С = 0- и NH-групп. Возможность таких измерений обусловлена тем, что эти группы поглощают сильнее всего тогда, когда они параллельны векто­ру Е. Это можно использовать для обнаружения а-спирали, учи­тывая, что теоретическое отношение величины поглощения для случаев, когда вектор Е параллелен и перпендикулярен оси бел­ка («дихроичное отношение»), составляет 44 при 3300 см^-1 (ва­лентное колебание NH—). Если измеряемое отношение близко к этой величине, велика вероятность а-спиральной структуры. Само теоретическое значение достигается редко, так как ориен­тация полипептидных цепей в пленке не может быть совершен­ной. Из измеряемых дихроичных отношений при 3300 и 1660 см^-1 (валентное колебание С = 0) можно, кроме того, рассчитать ве­личину максимального угла, который эти группы образуют с осью молекулы. Информация такого типа представляет собой большую ценность при интерпретации рентгенограмм.

Спектроскопия комбинационного рассеяния

Как правило, при рассеянии света его частота не меняется (так называемое упругое рассеяние); однако небольшая часть излу­чения, обычно в инфракрасной области, рассеивается неупруго с изменением частоты. Это называется рассеянием Рамана. Из­менение частоты в процессе рассеяния отличается от изменения