на рис. 14-11, удается точно определить концентрацию клеток или сухой массы на единицу объема.

Пример 14-Б. Исследование химических реакций. В ходе ре­акции должно изменяться поглощение одного из реагентов. В ка­честве примера из энзимологии рассмотрим измерение активности фермента р-галактозидазы. Эта методика широко используется в молекулярной биологии при изучении функционирования лак- тозного оперона. Этот фермент расщепляет о-нитрофенилгалак- тозид (ОНФГ) с образованием о-нитробензола, который можно определить по его поглощению при 420 нм. Так как, по крайней

394 Глава 14

РИС. 14-10.

Спектр поглощения фага Т7 Е. coli. Показана поправка на рэлеевское рассе­яние.

РИС. 14-11.

Концентрация бактерий, опреде­ленная путем измерения оптиче­ской плотности.

РИС. 14-12.

Изучение синтеза [3-галактозидазы путем измерения D_m продукта гидролиза о-нитрофенилгалактозида (ОНФГ). Три культуры, Lac^-, Lac+ и диплоид, содержащий две копии генов lac, выращивались в глицерин-солевой среде. При t=0 был добавлен стимулятор синтеза р-галактозидазы. Через различ­ные промежутки времени брали пробы и обрабатывали толуолом для того, чтобы убить клетки и отделить фермент; затем был добавлен ОНФГ. Через тридцать минут была измерена /)₄₂о- В результате этого опыта показано, что клетки Lac^- не продуцируют фермент, а диплоид продуцирует приблизитель­но в два раза больше, чем гаплоид.

мере в некотором интервале, скорость реакции пропорциональна концентрации фермента, из наклона кривой зависимости D от времени гидролиза (рис. 14-12) можно определить количество фермента.

Другой пример — ферментативный гидролиз полинуклеоти­дов. Согласно правилу 3 табл. 14-2, є (свободного основания) >є (основания в полинуклеотиде). Отсюда, если полинуклеотид гидролизуется до мононуклеотидов, то Є260 возрастает. Следова­тельно, если к образцу полинуклеотида добавить нуклеазу и из­мерить £)₂₆о как функцию времени, D₂во будет возрастать, и это возрастание указывает на гидролиз. Как и в случае р-галакто- зидазы, из наклона кривой зависимости Дгво от времени можно определить количество нуклеазы.

Третий пример — определение мощности дозы рентгеновской установки. Если облучить рентгеновскими лучами раствор FeS0₄ в H2SO4, ион Fe²+ превращается в Fe³+, который можно определить ПО его поглощению при 305 НМ. Из величины D305 можно рассчитать общую полученную дозу излучения.

Пример 14-В. Идентификация веществ путем спектральных измерений. Большинство веществ имеют характерные спектры поглощения и могут быть идентифицированы с их помощью. Для этого измеряют полный спектр либо отношение поглощений при различных длинах волн. Например, в первых работах по опре-

Абсорбционная спектроскопия 395

РИС. 14-13.

Зависимость оптической плотности трех растворов ДНК от температуры.

а — ДНК Е. сои (50% G-С) в 0,01 М фос­фатном буфере, pH 7,8; б — то же в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,8; в — ДНК Pseudomonas aeroginosa (68% GC) в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,8. Темпе­ратура, при которой изменение поглоще­ния составляет 50% от своей максималь­ной величины, называется температурой плавления Т_пл. Отметим, что Г_дл возра­стает с увеличением ионной силы раствора и содержания G-C-nap.

делению нуклеотидного состава ДНК ее гидролизовали и осно­вания разделяли хроматографически. Затем идентифицировали индивидуальные основания, получая их спектры и отмечая А_макс (в нм): 260,5 для аденина; 264,5 для тимина; 246 для гуанина и 267,0 для цитозина. Чтобы избежать получения полного спектра (для этого необходим автоматический регистрирующий спектрофотометр), воспользовались тем, что основания можно различить, измеряя отношение А>50/^280- Это отношение состав­ляет 2,00; 1,26; 1,63; 0,31 для аденина, тимина, гуанина и цито­зина соответственно. После идентификации оснований было оп­ределено количество каждого из них; для этого, как в примере 14-А, измеряли оптическую плотность, так как величины є при Амане (13,4-10³, 7,9-10³, 10,7-10³ и 6,Ы0³ соответственно) изве­стны. [Например, если D₂єо аденина была 0,65, молярная кон­центрация составила бы 0,65/(13,4-10³) =4,9-10~⁵ М.]

Пример 14-Г. Переход спираль — клубок в двухцепочечной ДНК: денатурация и ренатурация. Бш ДНК возрастает, если ДНК нагревается в определенном интервале температур (рис. 14-13). Эта так называемая гиперхромия является крите­рием денатурации или перехода спираль — клубок и возникает в результате нарушения стэкинга оснований ДНК, при разделе­нии двух полинуклеотидных цепей (см. правило 3 в табл. 14-2). Таким образом, с помощью простого оптического метода удается определить устойчивость ДНК к воздействию температуры, pH, ионной силы, к добавлению малых молекул, варьированию по­лярных и неполярных растворителей. Как видно из следующих примеров, этот метод явился мощным средством установления некоторых важнейших свойств ДНК. Во-первых, термическая устойчивость ДНК возрастает с увеличением содержания пар

АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ 397

РИС. 14-14.

График зависимости Тл_п от содержания G-С-пар в молекулах различных ДНК. Показаны величины Т_пл для двух различ­ных значений ионной силы. Отметим, что наклон кривых одинаков. [Из Marmur Doty P., J. Mol. Biol., 5, 109—118 (1962).]

a — 0,01 M фосфатный буфер + 0,001 M EDTA; 6 — 0,15 M NaCl + 0,015 M цитрат Na.

РИС. 14-15.

Кривые плавления раствора ДНК, полученные путем измерения D_2S0 в за­висимости от температуры (сплошная линия) или путем нагревания ДНК до определенной температуры (ниже 77,5°С), охлаждения до 25°С и последую­щего измерения D (та же линия). Температура, при которой происходит раз­деление цепей, находится в месте пересечения штриховой линии с осью абс­цисс.

гуанин — цитозин (рис. 14-14). Следовательно, пара оснований гуанин — цитозин связана, по-видимому, более прочно водород­ными связями, чем пара аденин — тимин. Во-вторых, если темпе­ратура возрастает (но не до величины, соответствующей макси­мальному поглощению) и затем понижается до температуры, ниже которой D не изменяется, тогда D немедленно падает до своей первоначальной величины. Это указывает на то, что при неполном разделении цепей нативная структура легко восста­навливается (рис. 14-15). При наличии межцепочечной ковалент­ной связи (что является особым случаем) поглощение всегда падает до своей обычной величины. В-третьих, разделения цепей не происходит, пока не будет полностью пройдена область пере­хода (например, 77,5°С, рис. 14-15), что можно не заметить, по-

РИС. 14-16.

Обнаружение ренатурации ДНК фага Т7 путем измерения £>₂вс-

Вначале ДНК была денатурирована в 0,01 М NaCl. При доведении концентрации NaCl до 0,5 М и понижении температуры до 20°С (/) беспорядочно образуются водородные связи и величина Г>₂₆о падает. Когда температура повышается до 76°С (2), случайно воз­никшие пары оснований разрушаются и D возрастает. Начинается образование правиль­ных пар оснований. Поскольку температура ниже той, которая необходима для разде­ления цепей, D понижается. Однако ДНК частично денатурирована при этой темпера­туре. Когда температура понижается до 20°С (3), все водородные связи восстанавлива­ются и ренатурация считается завершенной.

скольку разделение нескольких последних пар оснований вносит совсем незначительный вклад в общее изменение поглощения. В-четвертых, если нагреть ДНК выше температуры, при которой происходит разделение цепей, и затем охладить, возрастание поглощения в условиях высокой ионной силы (0,1) при последую­щем нагревании уменьшается от 37% (т. е. максимальной вели­чины) до 12%, так как новые водородные связи (внутри- и меж- цепочечные) формируются беспорядочным образом. Следова­тельно, при высокой ионной силе денатурированная ДНК агрегирует. Если ионная сила низка (0,01), то сохраняется мак­симальная величина D, потому что из-за отталкивания фосфат­ных групп цепи остаются разделенными. В-пятых, если ДНК, для которой наблюдается увеличение D на 12%, выдержать в ин­тервале ионной силы от 0,5 до 1,0 и при более высокой темпера­туре, чем Г_пл, отвечающая половине перехода (рис. 14-16), то через несколько часов D примет свою первоначальную величину; при этом концентрация ДНК должна быть высокой. Этот про­цесс называется ренатурацией и представляет собой возвраще­ние к нативной двухцепочечной структуре (см. гл. 1 и 18).

РИС. 14-17.

Кривые титрования тирозина, при построении которых использовали е₂95- Гипотетический белок содержит 5 тирозиновых остатков.

А—все пять остатков находятся на поверхности. В—два остатка на поверхности, а три — внутри, в неполярном окружении, и, следовательно, не титруются. В — три внут­ренних остатка находятся в полярном окружении и доступны растворителю.

Пример 14-Д. Спектрофотометрическое титрование белков. При многих исследованиях структуры белков возникает необхо­димость определения величины p/t диссоциации протонов иони­зуемых боковых групп аминокислот, поскольку эти величины указывают на локализацию аминокислоты в белке (правило 2 в табл. 14-2). Это часто можно сделать спектрофотометрически, так как при диссоциации зачастую меняется спектр одного из хромофоров (например, в случае тирозина); см. рис. 14-7. Рас­смотрим гипотетический тирозинсодержащий белок и для опре­деления числа внешних тирозиновых остатков воспользуемся правилом 2 (табл. 14-2). Предположим, что в этом белке име­ется пять тирозиновых остатков. Если все они расположены на поверхности и ионизуются при увеличении pH, спектр, отвечаю­щий остаткам тирозина, будет приближаться к спектру свобод­ного тирозина при высоких значениях pH, изображенному на рис. 14-7 (правило 26). Другими словами, зависимость D₂$s (X макс ДЛЯ' ионизованной формы) от pH будет выглядеть, как кривая А на рис. 14-17. Когда же, наоборот, три тирозиновых остатка расположены внутри в неполярном окружении, получен­ная кривая аналогична кривой Б (правило 2а); отношение вели­чины первого плато к конечной величине равно ~²/s- Отметим, что при очень высоких pH на кривой видно большое возраста­ние £>295- Это указывает на то, что внутренние тирозиновые ос­татки стали доступны растворителю, т. е. белок развернулся {денатурировал).

АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ 399