400 Глава 14

Если бы три внутренних тирозиновых остатка были в поляр­ном окружении, то получили бы кривую, похожую на кривую В, которая указывает, что эти три остатка имеют значение р/С, от­личное от такового для экспонированных групп (правило 2в).

Пример 14-Е. Определение некоторых особенностей конфор­мации белков методом пертурбации растворителем и дифферен­циальной (разностной) спектроскопии. Согласно правилу 1 табл. 14-2, спектры поглощения хромофоров зависят от поляр­ности их окружения. Это можно использовать для определения: 1) расположения хромофоров внутри или снаружи белка и 2) по­лярности окружения какой-нибудь внутренней аминокислоты.

Остановимся на п. 2, так как в этом случае легче следовать ходу рассуждений. Некоторый белок помещают в полярный ра­створитель и получают спектр поглощения внутреннего хромо­фора. Его сравнивают с известными спектрами того же хромо­фора в полярном и неполярном растворителях. Если полученный спектр сходен со спектром хромофора в неполярном раствори­теле, то хромофор должен находиться в неполярной области бел­ка, и наоборот; степень смещения Амане позволяет оценить сте­пень полярности.

Метод пертурбации растворителем позволяет определить в результате регистрации спектров поглощения белка в полярном и неполярном растворителях, является ли аминокислота внутрен­ней или внешней. Поскольку обычно представляет интерес опре­деление структуры белка в водных солевых растворах (модели­рующих нахождение белка в живой клетке), необходимо, чтобы неполярный растворитель сам по себе не вызывал конформаци- онных изменений, и это нужно всегда проверять другими мето­дами. В действительности белки очень редко изучают в неполяр­ных растворителях, так как большинство белков либо не раство­ряется, либо денатурирует в этих растворителях. В обычной практике используют растворитель, который на 80% состоит из воды, а на 20%—из вещества пониженной полярности. Некото­рые стандартные смеси приведены в табл. 14-3. Эти растворители с пониженной полярностью называются растворителями-пертур- бантами.

Наиболее удобным приемом, позволяющим применять метод пертурбации растворителем, является дифференциальная спек­троскопия, потому что в этом случае нет необходимости опреде­лять спектр дважды, т. е. в присутствии и в отсутствие пертур- банта. Обычно в абсорбционной спектроскопии спектр получают путем измерения поглощения раствора и вычитания поглощения растворителя (или, как описано выше, путем настройки спектро­фотометра на нуль по растворителю). В дифференциальной спектроскопии в двух кюветах для образца содержатся одинако-

ТАБЛИЦА 14.3

растворители, обычно используемые в методе пертурбации растворителем

Добавляемая жидкость (20 объемов! 100 объемов конечного раствора в Н_гО)

Диметилсульфоксид Этиле нгликоль

Диоксан Глицерин

Этанол

Добавляемое твердое вещество (20 г/100 г конечного раствора в Н_гО)

Арабит Полиэтиленгликоль

Эритрит Сахароза

Глюкоза Мочевина

Маннит

вые растворы, однако один из них содержит пертурбант. Вместо того чтобы измерять спектры обоих растворов, при каждой длине волны вычитается поглощение одного из поглощения другого 'ра­створа (конечно, необходимо, чтобы поглощение обоих раство­рителей было одинаковым при всех используемых длинах волн — именно так и происходит в случае растворителей, приведенных в табл. 14-3).

Дифференциальный спектр, отличный от нуля, будет появ­ляться только в том случае, если на спектр образца оказывает влияние пертурбант. Параметры, получаемые из таких спек­тров,— Хмакс и Де при Хмакс- На рис. 14-18 показаны дифферен­циальные спектры триптофана и тирозина (аминокислот, кото­рые наиболее часто изучаются методом пертурбации растворите­лем) в 20%-ном этиленгликоле.

Ниже следует пример анализа с помощью метода пертурба­ции растворителем, в котором используется дифференциальная спектроскопия; в качестве хромофора выступает триптофан. Рас­смотрим гипотетический белок с пятью триптофановыми остат­ками. Как видно из рис. 14-18, на дифференциальном спектре

РИС. 14-18.

Дифференциальные спектры тирозина (1) и триптофана (2) в 20%-ном вод­ном растворе этиленгликоля. Отме­тим, что на дифференциальных спек­трах Ае могут иметь отрицательные значения.