Бактеріологічне дослідження спинномозкової рідини хворого

1-й день дослідження

Спинномозкову рідина (СМЖ) у кількості 2 - 5 мл беруть у хворого відразу ж при надходженні в стаціонар (бажано до початку антибактеріальної терапії) з дотриманням всі правил асептики. Взяття ліквору проводиться персоналом в масках.

Першу порцію СМР (Близько 1,0 мл) беруть в окрему пробірку для проведення загального лікворологічного дослідження. Другу порцію, призначену для бактеріологічного дослідження наливають в стерильну пробірку (не менше 1.0 мл) і частково засівають в 0,1% напіврідкий агар (0,5 мл СМЖ додають в 5 мл 0,1% напіврідкого агару). Дотикатися руками країв канюлі, голки і країв пробірок заборонено. Ватно-марлеву пробку потрібно тримати на вазі за її зовнішню частину.

СМР досліджують негайно при доставці в лабораторію. Стерильною пастерівською піпеткою з дна пробірки беруть 0,3 - 0,5 мл матеріалу і по 2 - 3 краплі засівають на поверхню 2-х чашок Петрі з підігрітим живильним середовищем, розтираючи шпателем. Одна чашка містить "шоколадний" агар, друга - сироватковий. Посіви ставлять в термостат при +37 0 С і створюють умови підвищеного вмісту СО 2 в атмосфері термостату. Пробірку з ліквором в напіврідкому агарі інкубують в термостаті.

Нативна спинномозкова рідина, що залишилася в пробірці, досліджується в серологічних реакціях і використовується для приготування мазків.

H.influenzae видна в вигляді дрібних поліморфних грамнегативних паличок і ниток, оточених ледве помітною ніжною капсулою.

Пневмококки мають вигляд ланцетовидних диплококков та коротких ланцюжків, утворюють капсулу. Вони грампозитивні, добре фарбуються всіма аніліновими барвниками, при цьому капсула залишається незабарвленої і помітна тільки на забарвленому фоні.

Результати бактеріоскопії негайно повідомляють лікарю у вигляді попереднього відповіді. При достатній кількості досліджуваного матеріалу рекомендується 2 - 3 краплі засіяти в чашку з живильним середовищем для визначення чутливості до антибіотиків.

2-й день дослідження

Незалежно від результатів бактеріоскопії ліквору переглядають засіяні чашки. Перегляд чашок ведуть візуально і за допомогою бінокулярного стереоскопічного мікроскопа, лупи МБС. До уваги беруть всі колонії. Чашки з відсутністю зростання інкубують одну добу. Готують препарати-мазки, забарвлюють, ставлять реакцію з 3% розчином КОН і біохімічні тести - на оксидазу, каталазу, уреазу. Гемофілії властивий різкий специфічний запах.

Морфологія менінгококових колоній на "шоколадному" агарі - ніжні, сіруватого кольору, з блискучою поверхнею та рівними краями, мають маслянисту консистенцію, розмірами від 0,1 до 3,0 мм. Менінгококи не міняють кольору середовища. Якщо в мазках виявлені грамнегативні коки, це дає право віднести їх до роду нейссерій і провести диференціацію видів.

Гемофілії на "Шоколадному" агарі дають рясний ріст. Колонії сірого кольору, плоскі діаметром 0,2 - 2,0 мм, легко знімаються із середовища. У мазках, пофарбованих за Грамом, видно дрібні короткі грамнегативні палички з капсулою різної ступеня вираженості, а також нитки різної довжини і короткі ланцюжки. На сироватковому агарі H.influenzae не росте. Великі 3 - 5 мм колонії, що містять грамнегативні палички, схожі на ентеробактерії. Candida і P.aeruginosa ростуть щільно на всіх середовищах, не змінюючи кольору "Шоколадного" агару.

Колонії пневмококів на обох середовищах - дрібні (0,1 - 1,0 мм), іноді плоскі, з вдавленням в центрі. На "Шоколадному" агарі вони оточені зоною жовто-зеленого гемолізу (тип О±-гемолізу). За зовнішнім виглядом колонії пневмококів на обох середовищах важко відрізнити від колоній стрептококів групи В, ентерококів (S.feacalis), які в поодиноких випадках можуть викликати менінгіт, особливо у дітей 1 року.

В мазках з колоній пневмококи мають овальну або кулясту форму, розташовуються парами або в вигляді коротких ланцюжків з 2 - 3 пар. Якщо наявних рясний ріст однакових колоній, то допустимо одномоментний висів на диференційно-діагностичні середовища, вивчення культури по ряду ознак і антибіотикочутливості. Визначення чутливості ентеробактерій і стафілококів проводять на середовищі АГВ. Це середовище слугує основою для визначення чутливості до антибіотиків менінгококів при додаванні 20% сироватки H.influenzae і пневмококів - при додаванні відповідної кількості крові. Приготування поживних середовищ і постановка тесту на антибіотикочутливість проводиться відповідно до чинних вказівок.

На цьому етапі можлива видача остаточного результату, при позитивній реакції із специфічними антисироватками для H.influenzae, N.meningitidis і Str. pneumoniae.

Колонії, підозрілі на менінгококи, відсівається на скошений сироватковий агар або сектор чашки і інкубують при +37 0 С.

Якщо число вирослих колоній невелике (1 - 2), то їх відсівають на чашку з сироватковим або "Шоколадним" агаром для накопичення мікробної маси, а ідентифікацію мікроба проводять ще через одну добу.

При менінгітах новонароджених та дітей раннього віку, а також зрідка в інших вікових групах, крім трьох перерахованих видів мікроорганізмів етіологічними факторами можуть бути ентеробактерії (E.coli, S.marcescens, K.pneumoniae, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter), синьогнійна паличка (P.aeruginosa), Acinetobacter calcoaceticum, Listeria monocytogenes, різні стрептококи - гемолітичні групи В, і ентерококи, а також стафілококи (золотистий і епідермальний) і гриби роду Candida.

При підозрі на ентеробактерії, синьогнійну паличку, стафілокок і Ac.calcoaceticum проводять дослідження відповідно до методичних матеріалів.

При підозрі на лістерії в цей день, якщо число колоній дозволяє, ставлять ряд проб, а також тест на чутливість до антибіотиків. Для L.monocytogenes характерно: рухливість при кімнатній температурі, розкладання мальтози, глюкози, інактивність по відношенню до дульциту, маніту, сорбіту та арабінози. Сахароза і гліцерин розкладаються повільно. L.monocytogenes утворює крайову зону гемолізу на агарі з 5% баранячої крові, розлитому шаром 3 мм.

Для ідентифікації Candida albicans роблять посів з підозрілих білих випуклих колоній, складаються з дріжджових клітин, на середовище Сабуро або м'ясо-пептонний агар, містить по 100 МО/мл пеніциліну і стрептоміцину.

Якщо прямий посів на чашки з живильним середовищем не дав росту колоній, то робиться висів на чашки з сироватковим, "шоколадним" агаром з інкубованої в термостаті суміші ліквору з напіврідким агаром (середовище "збагачення").

3-й день дослідження

Культури, відсіяні з окремих колоній, переглядають під МБС та ставлять пробу з 3% розчином КОН.

Для оцінки чистоти вирослої культури готують мазки і дивляться. При виявленні морфологічно типових грамнегативних коків, проводять ідентифікацію, серогрупування ідентифікаційної культури, а також використовують цю культуру для визначення стійкості до лікування (якщо ці тести не були зроблені на 2-й день).

Враховують результати посівів, зроблених на 2-й день дослідження. На цьому етапі можлива видача остаточної позитивної відповіді для менінгококів та ін мікроорганізмів (крім пневмококів і стрептококів).

Для диференціації пневмококів і фекальних стрептококів (ентерококів) по мікроскопії чистих культур на середовищі кров'яного агару враховують характер гемолізу навколо вирослих колоній і ставлять додаткові проби.

На один з двох секторів кров'яного агару з ростом колоній накладають диск з фільтрувального паперу, просоченого 20% розчином жовчі (на фізіологічному розчині), після чого чашку поміщають при +37 0 С на 1 - 2 години. Після закінчення цього часу навколо диска колонії пневмококів лізуються, утворюючи зону відсутності зростання шириною 1 - 2 мм, в той час, як зростання інших стрептококів залишається інтактним. При позитивній пробі чутливості до жовчі, за умови типової морфології клітин і колоній, можна дати позитивну відповідь про виділенні пневмококів. Зростання культури на 2-му середовищі кров'яного агару використовують для постановки проби на чутливість до лікарських препаратів (якщо це не було зроблено раніше).

При негативних результатах проби на чутливість до жовчі, зростання на 2-му середовищі використовують не тільки для випробування чутливості до хіміопрепаратів, але і для постановки ряду тестів, диференціюють стрептококи.

У цей же день ставлять проби для ідентифікації інших можливих збудників, а також тест на лікарську чутливість (якщо це не було зроблено на 2-й день).

4-й день дослідження

Враховують результати посівів з метою диференціації менінгококів від непатогенних нейссерій і Br.catarrhalis і чутливості до хіміопрепаратів (якщо це не було зроблено на 3-ю добу). Можлива видача позитивної відповіді.

Культуру менінгококів, вирослу на сироватковому агарі при +37 0 С, можна використовувати для серологічної ідентифікації менінгококів в реакції аглютинації або в реакції преципітації в агарі, а також для визначення лікарської стійкості.

Враховують результати проб на лікарську чутливість та інші властивості у інших збудників, видають остаточну позитивну відповідь.