Рнга при імуно-епідеміологічних дослідженнях

Метою імуно-епідеміологічних досліджень є визначення числа осіб ймовірно сприйнятливих до менінгококової інфекції та груп ризику. Аналіз проводять за кількістю серопозитивних і серонегативних осіб з урахуванням існуючої епідемічної ситуації.

Наприклад, в період епідемічного неблагополуччя збільшується число серопозитивних осіб та відповідно зменшується число серонегативних до епідемічної серогрупи менінгококів. У період спорадичної захворюваності, навпаки, зростає число серонегативних осіб.

При проведенні імуно-епідеміологічних досліджень серед населення обсяг репрезентативних вибірок встановлюється епідеміологом у відповідності з чисельністю та віковим складом колективу, району, населеного пункту.

Обумовлений фоновий рівень протименінгококових антитіл пов'язаний із захворюваністю менінгококовою інфекцією на даній території і рівнем носійства. Найбільш високий рівень антитіл в різні епідемічні періоди визначають до менінгококів серогрупи В, що, можливо, відображає їх серологічне спорідненість з E.coli K1, моракселою, непатогенними нейсеріями. При цьому кількість серопозитивних проб з титрами антитіл 1:20 і вище може досягати 90%.

До менінгококів серогрупи С рівень антитіл найменший, число серопозитивних сироваток з титром антитіл 1:20 і вище становить 8%.

Рівень антитіл до менінгококів серогрупи А дає досить чітку характеристику епідеміологічної ситуації і відображає широту циркуляції збудника.

Аналіз серологічних результатів епідеміологічних досліджень проводять на підставі розрахунку наступних показників:

а) частки серонегативних проб, отриманих з кожним з еритроцитарних діагностикумів (А, В і С), який може відображати число ймовірно сприйнятливих осіб до менінгококової інфекції;

б) частки серопозитивних проб (всі серопозитивні сироватки крові, починаючи з розведення 1:5 і вище), з числа яких виділяють проби з титрами антитіл:

- у віковій групі до 3-х років з 1:10 і вище до полісахаридів А і С, з 1:20 і вище до полісахариди В;

- у старших вікових групах у дітей і у дорослих з 1:20 і вище до полісахаридів А і С, з 1:80 і вище до полісахариди В. Відсоток сироваток крові з зазначеними вище рівнями антитіл відображає домінуючу на даній території серогрупу менінгококів.

Застосування рнга для оцінки ефективності вакцинопрофілактики менінгококової інфекції

Формування поствакцинального імунітету носить групоспецифічний характер. У зв'язку з цим, в залежності від використовуваної для профілактики менінгококової вакцини, серологічні дослідження для оцінки ефективності вакцинації проводять з застосуванням РНГА з гомологічним еритроцитарних діагностикумів.

При вакцинації дорослих специфічні протименінгококові антитіла до полісахариду А виявляють у високих титрах (1:40 - 1:640 і вище) не менше ніж у 80% щеплених вже на 3 - 4 тижня після вакцинації. Протягом наступних 6 - 8 місяців у щеплених титри антитіл кілька знижуються, але зберігаються на підвищеному рівні не більше двох років.

Сучасні методи генодіагностіки гнійних бактеріальних менінгітів

Сучасні методи генодіагностікі гнійних бактеріальних менінгітів засновані на застосуванні полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Принцип ПЛР полягає в багаторазовій ампліфікації генетичного матеріалу, що міститься в досліджуваному зразку, з допомогою ферменту термостабільної ДНК-полімерази. При генодіагностікі ГБМ як зразок використовуються початково стерильні рідини організму людини, в першу чергу, спинномозкова рідина. Розмноженню й ідентифікації піддають фрагменти геному збудників ГБМ, тобто менінгококів, пневмококів, гемофільної палички.

Генотипування передбачає більш детальну характеристику ампліфікованих ділянок геному з допомогою ряду методик.

В порівнянні з традиційними методами діагностики, генодіагностіка з використанням ампліфікаційних технологій вирізняється високою чутливістю і дозволяє використовувати для діагностики зразки, в яких не міститься живих збудників, тільки фрагменти їх генетичного матеріалу.

Результати генотипування характеризуються більшою однозначністю в порівнянні з морфологічними, біохімічними або імунологічними методами класифікації мікроорганізмів і надають безпосередню інформацію для з'ясування еволюційних і епідеміологічних зв'язків різних ізолятів бактерій.

Загальні відомості та принципи

Геном ДНК збудників ГБМ являє собою досить велику кільцеву хромосому, так, наприклад, геном N.meningitis складається з 2.3 мільйона пар основ і близько 2160 генів. Функції багатьох генів ще невідомі, однак серед них можна виділити унікальні ділянки, специфічні для даного роду, виду й підвиду мікроорганізмів. Власне генодіагностіка і полягає в тому, щоб розмножити і впізнати подібну ділянку, що може бути зроблено за допомогою ПЛР.

Принцип ПЛР був описаний в 1986 р. В основі цього методу лежить багаторазове копіювання з допомогою ферменту ДНК-полімерази певного фрагмента ДНК.

Показання до застосування методу

Показання до застосування нового методу починаються там, де виникають протипоказання до застосування класичних методів. Ідентифікація патогена шляхом мікробіологічного культивування із зразків спинномозкової рідини або крові хворого, залишаючись "золотим стандартом" діагностики, має серйозні обмеження, обумовлені застосуванням антибіотиків на догоспітальному етапі. Згідно з Наказом № 375 МОЗ РФ "... вдома слід ввести разову дозу пеніциліну, а при тяжкій менінгококцемії переважне введення левоміцетину-сукцинату ". Подібна практика покращує прогноз захворювання, але різко зменшує кількість зразків СМЖ, придатних для мікробіологічного та подальшого епідеміологічного аналізу.

Останніми роками близько половини хворих ГБМ, що надходили в інфекційну клінічну лікарню отримували антибіотики на догоспітальному етапі; при цьому в групі хворих, які отримували антибіотики на дому, летальність була менше 5%, а культуру бактерій з СМР (або крові) вдавалося отримати лише у 30% випадків; навпаки, в групі хворих, які не отримали антибіотики, летальність була вищою 10%, а культуру бактерій отримували як мінімум в 60% випадків. Крім того, бактеріологічна діагностика займає не менше доби. Таким чином, ситуація вимагає розробки і застосування "некультуральних" методів ідентифікації збудників ГБМ.

Відомим "Некультуральним" методом виявлення антигенів збудників ГБМ є метод латекс-аглютинації (ЛА) із застосуванням відповідних комерційних тест-систем. Латексні частинки, покриті специфічними антитілами до антигенів Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae або Haemophilus influenzae, аглютинують у присутності бактеріальних антигенів, що містяться в СМР; результат аглютинації оцінюється візуально. Постановка всієї реакції займає близько 10 хв, реакція не вимагає наявності живих бактерій в СМЖ. Однак чутливість методу ЛА порівняно невисока, порядку 70%, що не дивно, оскільки мінімально визначувана концентрація бактерій в СМР методом ЛА складає від 10 5 до 5 * 10 6 бактерій/мл або від 1 до 50 нг антигену/мл. При цьому вартість тест-систем в перерахунку на одну діагностичну реакцію не менше.

Основні пріоритети ПЛР:

· можливість виявлення навіть декількох копій геному бактерій у зразку і, як наслідок максимальна діагностична потужність;

· чутливість і специфічність, що сягають 100%, висока відтворюваність;

· стислі (протягом декількох годин) терміни дослідження;

· помірна і постійно знижується собівартість (від 100 рублів на одну реакцію).

Показаннями до генодіагностіки ГБМ є:

·   негативні результати діагностики іншими методами;

·   використання для діагностики зразків СМЖ, узятих після антибіотикотерапії або на пізніх стадіях хвороби;

·   необхідність термінового діагностичного результату;

·   заміщення дорогих імунологічних методів.

Прямих протипоказань до застосування генодіагностіки ГБМ не існує. Однак, з одного боку, ПЛР здатна виявити найменше бактеріальне забруднення тестованого зразка і робочих розчинів, з іншого боку, в ряді біологічних рідин, в тому числі, СМЖ можлива присутність інгібіторів ПЛР. Тому тільки використання при постановці реакції позитивних і негативних контролів, висока і періодично перевіряється якість всіх використовуваних реагентів, акуратність виконання дослідження дозволяють уникнути як хибнопозитивних, так і хибнонегативних результатів.