Техника постановки риф-абс

Из антигена готовят препараты на тонких, хорошо обезжиренных предметных стеклах, на обратной стороне которых стеклорезом обозначены кружки диаметром 0,7 см (по 10 кружков на 1 предметном стекле). В пределах кружка, на стекло наносят антиген - взвесь бледных трепонем. Запаянным концом пастеровской пипетки круговыми движениями взвесь распределяют в пределах кружка, высушивают на воздухе и фиксируют 10 минут в химически чистом ацетоне. Затем препараты нумеруют. Инактивированные испытуемые сыворотки крови разводят в 5 раз сорбентом, разведенным по титру буферным раствором. В штатив помешают ряд пробирок, число и номер которых соответствует числу и номеру испытуемых сывороток крови. В пробирки пипеткой разливают разведенный по титру сорбент по 0,2 мл, затем добавляют по 0,05 мл цельной испытуемой сыворотки крови и хорошо перемешивают. Разведенные сорбентом сыворотки крови наносят на антиген так, чтобы равномерно покрыть мазок, и препараты помещают во влажную камеру, которую закрывают крышкой и помещают на 30 минут в термостат при 37 град. С (I фаза реакции). После первой фазы препараты осторожно промывают в 2 порциях фосфатного буфера, причем во вторую порцию препараты помещают на 10 минут, высушивают, после чего их вновь помещают во влажную камеру, наносят разведенную по титру люминесцирующую сыворотку и оставляют при комнатной температуре на 30 минут (II фаза реакции). По окончании второй фазы препараты промывают фосфатным буфером, как описано выше, высушивают и наносят на поверхность мазков по капле нелюминесцирующего иммерсионного масла (диметилфталата).

Исследование препаратов производят в люминесцентном. Учет реакции осуществляется путем оценки свечения бледных трепонем. Положительными в РИФ-абс считают сыворотки крови, которые дают свечение на 4+, 3+ и 2+. Блестящее зелено - желтое свечение оценивается на 4+, яркое - 3+, слабое свечение - 2+. Отрицательными считают сыворотки крови, которые дают свечение на 1+ (трепонемы в препарате окрашены интенсивнее фона) или не дают его.

В каждой постановке РИФ-абс необходимо использовать резкоположительные, слабоположительные и неспецифические контроли.

Контроли антигена, сорбента, люминесцирующей сыворотки могут ставиться только при использовании новых серий этих ингредиентов.

Методика постановки риф-абс с капиллярной кровью

Постановка РИФ-абс возможна не только с сывороткой крови, но и с кровью, взятой из пальца. Эту модификацию РИФ-абс можно использовать при обследовании на сифилис детей, при трудности получения крови из вены у взрослых, при массовом обследовании различных контингентов на сифилис.

При постановке РИФ-абс с кровью применяют те же ингредиенты реакции, что и при постановке РИФ-абс с сывороткой крови (антиген, сорбент, люминесцирующая сыворотка).

Кровь для исследования после прокола пальца пациента набирают микропипеткой до метки 0,1 мл, быстро выдувают в пробирку, содержащую 0,3 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают пипеткой и фильтруют через бумажный фильтр, смоченный дистиллированной водой. Постановка реакции с разведенной кровью возможна как в день взятия ее, так и через 1-2 дня при условии хранения при 4 град. С

Непосредственно перед постановкой реакции ко всем образцам крови, включенным в постановку реакции, добавляют по 0,1 мл цельного сорбента, перемешивают пипеткой и встряхиванием, помещают на 30 минут в термостат при 37 град. С. Затем кровь, обработанную сорбентом, наносят на мазки антигена и помещают ее во влажную камеру при 37 град. С (I фаза реакции). По истечении срока экспозиции препараты промывают в первой порции фосфатного буфера так, чтобы на стеклах не осталось следов крови, и помешают их на 10 минут во вторую порцию буфера. После высушивания мазков проводят II фазу реакции. При этом на препараты наносят разведенную по титру, установленному для данной модификации РИФ, люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека. Стекла во влажной камере вновь помещают в термостат при 37 град. С.Через 30 минут препараты вновь промывают в 2 порциях фосфатного буфера в течение 10 минут, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии. Исследование препаратов и учет результатов реакции проводят так же, как при постановке РИФ-абс с сывороткой крови.

Методика постановки РИФ-200

Методика постановки РИФ-абс и РИФ-200 близки. При постановке РИФ-200 обработка испытуемых сывороток крови, приготовление антигена, подготовка антивидовой люминесцирующей сыворотки и ее титрование производят так же, как при постановке РИФ-абс. Следует учесть только, что титры люминесцирующей сыворотки, выпускаемой в настоящее время, в РИФ-200 колеблются от 1:20 до 1:50.

Техника постановки РИФ-200.

Испытуемые сыворотки крови разводят в 200 раз фосфатным буфером. При постановке реакции на помещенные во влажную камеру препараты наносят разведенные в 200 раз испытуемые сыворотки крови так, чтобы их номера, обозначенные на пробирках, соответствовали номерам на предметных стеклах. После нанесения на препараты сыворотки крови влажную камеру помещают на 30 минут в термостат с температурой 37 град. (I фаза реакции). Затем препараты промывают 10 минут в 2 порциях буфера и высушивают. После этого их вновь помещают во влажную камеру и на все наносят разведенную по титру люминесцирующую сыворотку (II фаза реакции). Вторую фазу проводят 30 минут при комнатной температуре, после чего препараты 10 минут промывают, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии.Учет результатов РИФ-200 производят так же, как РИФ-абс.

В том случае, когда клиницистов интересует титр флюоресцирующих антител в сыворотке крови больного, РИФ-абс и РИФ-200 следует ставить с последовательным разведением испытуемых сывороток крови и титром флюоресцирующих антител считать то наибольшее разведение сыворотки крови, которое еще дает положительный результат реакции. Обозначать титр принято числом, характеризующим степень разведения испытуемой сыворотки крови, например, 5,10,20,40 и т. д. (РИФ-абс) или 200,400, 800 и т. д. (РИФ-200).

В связи с возможностью получения отрицательных результатов при наличии флюоресцирующих антител не следует исследовать кровь и сыворотку крови в РИФ-абс и РИФ-200 во время лечения больных пенициллином.