Лабораторная работа № 2 приготовление питательных сред

Цель работы. Приготовление питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей на примере среды Мурасиге-Скуга

Теоретическое обоснование. Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы, витамины, углеводы, фитогормоны. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, определенные аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, повышающие доступность железа для клеток в широких пределах рН.

Углеводы выступают необходимым компонентом питательных сред при культивировании изолированных клеток и тканей, так как они не способны к автотрофному питанию. Обычно в качестве источника углеводов используют сахарозу или глюкозу в концентрациях 20-40 г/л. Опухолевые ткани, в которых много активных гидролитических ферментов, могут расти на средах с растворенным крахмалом.

Регуляторы роста необходимы для дифференцировки клеток и для индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред должны входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины, индуцирующие деление дедифференцированных клеток. В случае индукции стеблевого морфогенеза можно снизить содержание ауксинов в среде или исключить их из питательной среды. На средах без гормонов растут опухолевые и «привыкшие» к таким условиям ткани. Автономность по отношению к гормонам того и другого типа или к одному из них связана со способностью клеток синтезировать гормоны.

В качестве источников ауксинов в питательных средах обычно используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 1-10 мг/л, а также индолилуксусную кислоту (ИУК) – 1-30 мг/л, и -нафтилуксусную кислоту (НУК) – 0,1-2 мг/л. ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. Для индукции образования каллуса обычно применяют высокие концентрации ауксинов, а при последующих пересадках ткань может расти, если содержание ауксинов в среде уменьшено в несколько раз.

В качестве источника цитокининов в искусственных питательных смесях используют кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин (0,001-10 мг/л). Зеатин и БАП более активны в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза, чем кинетин. В состав некоторых питательных смесей входит аденин.

Отдельные питательные среды включают кроме ауксинов и цитокининов гибберелловую кислоту (ГК). Иногда к питательной среде добавляют растительные экстракты или соки. Наибольшей ростактивирующей способностью обладает кокосовое молоко-жидкий эндосперм кокосового ореха.

Для приготовления твердых питательных сред используют агар-агар-полисахарид, получаемый из морских водорослей. Наименьшее количество нежелательных примесей содержат бактериальный агар «Difco» и бактериальный агар отечественного производства, их можно применять без предварительной промывки. Обычно для получения твердой питательной смеси к среде добавляют 5-8% агара.

Растворы макросолей, микросолей и витаминов удобно готовить концентрированными. Маточные растворы хранят в холодильнике, витамины при отрицательной температуре. В 10-20 раз более концентрированными, чем нужно, готовят растворы макросолей, в 100-1000 раз более концентрированными-растворы микросолей, в 1000 раз-растворы витаминов.

Для культивирования клеток, тканей и органов тех или иных растенийиспользуют питательные среды различного состава. Наиболее широко применяются среда Мурасиге-Скуга (табл.1, 2), среда Уайта (табл.2.3), среда Гамборга, или В-5 (табл.2.4).

Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Химреактивы (табл.1). Колбы или стаканы химические на 1л, банки с притертыми пробками для хранения маточных растворов на 1л и 100мл, баночки на 20-50мл, мерные пипетки на 10 и 1мл, весы технические, весы торзионные, электроплитка.

Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Приготовить питательную среду Мурасиге и Скуга (табл.1, 2) для культивирования растительных органов и тканей.

Прежде всего необходимо приготовить маточные растворы макро-, микросолей и витаминов. Для среды Мурасиге и Скуга обычно готовят маточные растворы следующего состава: 1) NH₄NO₃, KNO₃, KH₂PO₄, MgSO₄ ^.7H₂O (MgSO₄ ^. 7H₂O вливают последним без нагревания, что предотвращает выпадение осадка); 2) раствор CaCl₂ ; 3) раствор хелата железа (раствор FeSO₄ и ЭДТА-Na₂, необходимый для образования хелата железа, следует нагреть до кипения); 4) раствор микроэлементов.

Количество солей, необходимое для приготовления маточных растворов, а также количество маточного раствора, которое надо взять для приготовления питательной среды, приведены в табл. 2.2.

Полученные растворы сливают в склянки с притертой пробкой, снабжают этикеткой и хранят в холодильнике. Хелат железа хранят в темной склянке.

Концентрированные растворы витаминов (каждого в отдельности) хранят во флакончиках. Для приготовления растворов берут десятикратную по отношению к добавляемой дозе навеску витамина и растворяют в 10 мл воды. В 1 мл этого раствора содержится порция витамина, необходимая для приготовления 1 л раствора по прописи Мурасиге-Скуга.

Теперь, используя маточные растворы, надо приготовить питательные среды для культивирования органов и тканей растений. В химический стакан или колбу емкостью 1л помещают навеску сахарозы 30 г, доливают до половины дистиллированную воду, нагревают, после растворения сахарозы добавляют необходимые количества маточных растворов макросолей, микросолей (см. табл. 2.2.), витаминов и доводят объем до 1л дистиллированной водой.

Растворы фитогормонов готовят следующим образом.

Ауксины ( 2,4-Д, -НУК, ИУК, индолил-масляная кислота – ИМК): 100 мг вещества растворяют в 0,5-2 мл спирта, подогревают, добавляют дистиллированную воду до 100 мл (концентрация 1 мг/мл).

Цитокинины (кинетин, зеатин, БАП): растворяют в небольшом объеме 0,5 н. HCl, подогревают, добавляют соответствующий объем дистиллированной воды.

Абсцизовая кислота (АБК): навеску растворяют в 70%-ном этаноле, доводя до нужного объема.

Гиббереллиновая кислота (ГК): навеску растворяют в воде.

При введении фитогормонов в среду перед автоклавированием следует обязательно довести рН среды до 5,5-5,6. Однако следует учитывать, что после автоклавирования изменяется первоначальный состав термолабильных компонентов среды. Так, тиамин распадается на пиримидин и тиазол, а кинетин и ИУК теряют часть своей активности. В связи с этим витамины и особенно термолабильные фитогормоны стерилизуют фильтрованием, пропуская через фильтр Зейца или «Миллипор» с диаметром пор 0,4 мкм (НУК, ИУК, зеатин, БАП). В этом случае для регуляции рН среды используют стерильные растворы щелочи.

Агар-агар предварительно замачивают в воде для набухания. Затем его нагревают на электроплитке при помешивании до полного растворения. После этого раствор агара надо слить с раствором солей, витаминов и сахарозы и довести объем среды до 1л. Колбы со средой закрывают ватной пробкой, бумагой или фольгой и стерилизуют в автоклаве.

Питательные среды разливают в пробирки (1/3 объема), которые закрывают ватными пробками или фольгой, стерилизуют в автоклаве.

Требования к отчету по лабораторной работы

Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.

Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Контрольные вопросы.

1. Каков состав питательных сред для изолированных клеток и тканей?

2. Какие вещества используют в качестве ауксинов в питательных средах?

3. Что такое маточные растворы и как их готовят?

Литература

1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.

2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.

3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.

3. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.

4. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.

5. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.

Приложение.

Таблица 1. Среда Мурасиге и Скуга, рН 5,6-5,8

Компоненты	Содержание, мг/л	Компоненты	Содержание, мг/л
NH4NO3	1650	Fe2SO4 7H2O	27,8
KNO3	1900	Na2-ЭДТА 2H2O	37,3
CaCl2 . 2H2O	440	Тиамин - HCl	0,1
MgSO4 . 4H2O	370	Пиридоксин - HCl	0,5
KH2PO4	170	Никотиновая кислота	0,5
MnSO4 . 4H2O	22,3	Мезо-инозит	100
CoCl2 . 6H2O	0,025	Глицерин	2,0
ZnSO4 . 7H2O	8,6	ИУК	2,0
CuSO4 . 5H2O	0,025	Кинетин	0,2
Na2MoO4 . 2H2O	0,25	Сахароза	30.000
Kl	0,83

Таблица 2. Состав маточных растворов по Мурасиге и Скугу

Компоненты питательной среды Примечание Макросоли, г/л маточного раствора КNO3 38 CaCl2 (безводный) 8,8 NH4NO3 33 или CaCl2 . 2H2O 13,8 MgSO4 (безводный) 3,6 или MgSO4 .7H2O 7,4 KH2PO4 3,4 На 1 л среды брать по 50мл маточного раствора Микросоли, мг/100 мл маточного раствора H3PO4 620 MnSO4 . 4H2O 2230 ZnSO4 860 Kl 83 Na2MoCl4 . 2H2O 25 CuSO4 . 5H2O 2,5 CoCl2 . 6H2O 2,5 На 1 л среды брать по 1 мл маточного раствора Fe-хелат, мг/100 мл маточного раствора FeSO4 .7H2O 557 ЭДТА-Na2 (трилон Б) 745 На 1 л среды брать по 5 мл маточного раствора